급성 백혈병에서 extracellular signal-regulated kinase(ERK) 활성화의 분자생물학적 기전

Abstract

[한글]

Extracellular signal-regulated kinase (ER7)는 다양한 종류의 세포표면 수용체로부터 시작되는 신호전달체계의 중요한 매개체로, 세포의 성장과 분화에 필요한 신호정보를 통합하고 이를 핵내로 전달하는 기능을 하는 것으로 알려지고 있다. 여러 연구결과에 의하

여, stem cell factor, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, interleu-kin-3 및 interleukin-5 등을 포함한 다양한 조혈 사이토카인에 대한 세포반응을 매개하는 신호전달과정에서 ERK가 관여하는 것으로 보고되고 있어, 조혈세포의 성장 및 분화에 있어서 ERK의 중요성이 강조되고 있다. 최근들어 ERK를 활성화시켰을 때, 세포의 증식 및 형태학적 변형을 유발하여 암세포로의 변화를 야기시키는 것으로 보고되고 있으며, 일부 연구에서는 인체 암세포들에서 ERK의 활성화를 보고하고 있으나, ERK 활성화의 조절기전에 대해서는 아직 정확히 밝혀지지 않고 있다.

급성 백혈병은 계열 특이성을 보이는 전사인자 혹은 종양유전자의 클론성 염색체이상으로 특징지워지는 혈액암으로, 이러한 염색체이상은 정상적인 조혈세포의 분화를 억제하여 백혈병세포로의 전환을 야기하는데 중요한 역할을 한다고 알려지고 있다. 그러나 급성

백혈병세포가 완벽한 악성 종양세포로 되기 위해서는 백혈병화 과정에서 이러한 클론성 염색체이상 이외에 여러 가지 다른 전환과정이 요구된다고 보고되고 있다 이러한 점을 고려하여 최근 조혈세포의 성장 및 분화를 야기하는 신호전달체계에 대한 연구가 광범위하게 진행되고있는 바, 이에 본 연구에서는 급성백혈병세포를 대상으로 세포의 증식 및 분화과정을 위한 세포내 신호전달경로에 있어서 가장 중요한 kinase인 ERK를 분석하고 ERK활성화의 조절기전 및 생물학적 역할에 대하여 검토하였다.

본 연구는 79례의 급성 백혈병환자와 10례의 정상 골수공여자에서 채취한 골수세포를 대상으로 하였으며, 분리된 세포로부터 단백질을 추출한 후 in vitro kinase assay 및 immunoblot 검사를 시행하여 급성 백혈병에서 ERK와 MAP kinase/ERK-activating kinase (MEK) 활성화 여부 및 양자간의 상관성을 알아보았다. 그리고 ERK 활성화에 ERK의 표현정도가 기여하는지 여부를 검토하기 위하여 semi-quantitative RT-PCR 및immunoblot검사를 시행하여 ERK의 표현정도를 조사하였으며, ERK의 불활성화기전의 장애 여부를 알아보기 위하여 ERK-특이 protein tyrosine phosphatase인 phosphataseof activated cells (PACI)의 표현정도를 조사하였다. 마지막으로 ERK의 생물학적 역할 및 ERK 억제제의 치료제로서의 가능성을 제시하고자, 활성화된 ERK를 억제시세포사망 및 세포사망 조절유전자에 어떠한 영향을 미치는지를 연구하였다. 이상의 실험을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. In vitro kinase assay를 통하여 ERK의 활성도를 조사하였을 때, 79례의 급성 백혈병세포의 평균 ERK 활성도는 16.6 densitometric unit (±1.2 SE)로 정상 골수세포(5.2 densitometric unit±1.2 SE)보다 유의하게 높은 ERK 활성도를 나타내었다(f=0.003). 26례의 급성 백혈병세포를 대상으로 인산화-특이 ERK 항체를 이용하여 immunoblot검사를 시행하였을 때, 1971 (73.1%)에서 ERK가 활성화된 소견을 보여주었다.

2. 인산화-특이 MEK항체를 이용하여 MEK활성화를 조사하였을 때, 27례의 급성백혈병세포중 2171 (80.8%)에서 MEK가 활성화되어 있었으며,26례의 급성 백혈병세포중 147Bl (53.8%)에서 ERB? 활성화양상은 MEK 활성화양상과 동일하였으나, 이 상관관계는 통계적으로 유의하지는 않았다 (f=0.28).

3. Semi-quantitative RT-PCR상, 79례의 급성 백혈병세포들의 ERK2 유전자표현의 평균치는 0.43 (±0.01 SE)으로 정상 골수세포 (0.10±0.01 SE)보다 유의하게 높은ERK2 유전자표현을 나타내었다 (f=0.03). 26례의 급성 백혈병세포를 대상으로 총 ERK항체를 이용하여 immunoblot검사를 시행하였을 때, 14례 (53.8%)에서 ERX가 과표현되어 있었으며, 26례의 급성 백혈병세포중 17례 (65.4%)에서 ERK 활성화양상은 ERK 표현양상과 동일하였으나, 이 상관관계는 통계적으로 유의하지는 않았다 (f=0.19).

4. 비정상적인 ERK 불활성화기전이 존재하는지 여부를 알아보기 위하여 semi-quantitative RT-PCR을 통한 PACI 유전자의 표현을 조사하였을 때, 급성 백혈병세포의 PACI 유전자표현의 평균치는 0.23 (±0.01 55)으로 정상 골수세포 (0.58±0.01SE)보다 유의하게 낮은

PACI 유전자표현을 나타내었다 (f=0.002). ERK 활성화와 PACI down「e링ration간의 상관성을 알아보았을 때, 26례의 급성 백혈병세포중 2271(84.6%)에서 상관성을 보여, 통계적으로 유의한 상관성을 나타내었다 (f=0.002).

5. CEM세포주에서 anti-Fas IgM과 adriamycin을 처리하여 세포사망을 조사하였을때, ERK 억제군에서 대조군에 비하여 유의한 세포사망의 촉진을 관찰하였으며 (P<0.01), 이때 ERK 억제군에서 세포사망 억제유전자인 Mcl-1 표현이 감소됨을 확인하였다.

이상의 결과로 대부분의 급성 백혈병세포에서 ERK와 MEK는 활성화되어 있으며, 상위의 단계적 kinase에 의한 활성화 이외에 ERK의 과표현 그리고 PAC1의 down regulation이 ERK의 활성화에 기여하는 것으로 생각된다. 또한 이러한 조절기전간의상호 보완적인 작용이 급성 백혈병세포에서 ERK 활성화의 조절기전으로 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 마지막으로 ERK는 백혈병세포의 생존 및 세포사망에 중요한 역할을 할 것으로 생각되며, 추후 급성 백혈병에서 ERK의 다른 생물학적 역할및 ERK 억제제의 백혈병 치료제로서의 가능

성에 대한 연구가 뒤따라야 할 것으로생각된다.

[영문]

Extracellular signal-regulated kinase (ERK) is a signaling molecule common to pathways that regulate the proliferation and differentiation in diverse cell types including hematopoietic cells. In blood cells and their precursors, the activation

of ERK has been shown to be involved in the proliferation and cellular response of various hematopoietic cytokines,including steel factor, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, interleukin-3 and interleukin-5.

Recently, constitutive activation of ERK elicits oncogenic transformation in fibroblast, and has been observed in some of human malignancies, including acute leukemia. However, mechanisms underlying constitutive activation of ERK have not been well characterized.

To find the molecular mechanisms and biologic role of ERK activation in acute leukemia,79 human acute leukemia samples were examined by semi-quantitative RT-PCR and immunoblot analysis. The results are as followings;

First, ERK and MAP kinase/ERK-activating kinase (MEK) were constitutively activatedin acute leukemias by in vitro kinase assay and immunoblot analysis.

However, in onlyone-half of the studied samples, the patters of ERK activation was similar with that of MEK activation. By semi-quantitative RT-PCR and immunoblot analysis, hyperexpression of ERK was demonstrated in a majority of acute leukemias.

In 17 of 26 cases (65.4%) analyzed by immunoblot, the pattern of ERK expression was similar with that of ERK activation. Next, phosphatase of activated cells (PACI), a ERK-specific phosphatase, gene expression in acute leukemias showing constitutive ERK activation was significantly lower than that in unstimulated, normal BM samples showing minimal or no ERK activation (P=0.002).Also, a significant correlation was observed between PACI downregulation and phosphorylation of ERK in acute leukemias (f=0.002). Finally, in CEM leukemic cell line, inhibition of ERK potentiated Fas and chemotherapy-induced cell death. In addition, the expression of Mcl-1, an antiapoptotic member of the Bcl-2 family, was down regulated during ERK inhibition.

These results suggest that ERK is constitutively activated in a majority of acute leukemias, and in addition to the activation of MEK, the hyperexpression of ERK and downregulation of PACI also contribute to constitutive ERK activation in acute leukemias. Also, activation of ERK in acute leukemia may enhance the expression of Mcl-1 and potentiate the leukemic cell survival.