Retroviral vector를 이용한 조혈모세포 형질도입에 대한 조혈촉진인자 및 fibronectin의 효과

Abstract

[한글]

조혈모세포에서 retroviral vector를 이용한 형질도입의 효과를 향상시키고 보다 빠른 시일 내에 분화가 되지 않은 형질도입된 조혈모세포를 선택적으로 분리하기 위해서는 조혈촉진인자의 종류 및 세포외기질 등의 사용에 관한 다각적 검토가 필요하며, 각 조건에 따른 형질도입 효과 및 조혈모세포 성상의 변화를 관찰하기 위해서는 빠른 시일 내에 비교 ·분석할 수 있는 표지유전자의 사용이 필수적인 요건이라 할 수 있다. 이에 저자는 1)retroviral vector를 이용하여 intracytoplasmatically truncated human low-affinity nerve growth factor receptor (△LNGFR)의 도입효과를 기존의 drug selection 방법과 비교함으로서 형 질 도입된 조혈모세포를 보다 빠른 시일 내에 선택적으로 분리할 수 있는 방법론을 확립 하고 2) 조혈촉진인자 종류 및 recombinant human fibronectin fragment (retronectin) 사용 유무에 따른 형질도입 효과를 비교하여 가장 효율적인 형질도입 조건을 모색하며 3)표지유전자가 도입된 조혈모세포의 성상변화를 세포면역학적 및 기능적 분석을 시행하여 확인함으로서, 향후 조혈모세포를 이용한 유전자 치료에 있어서 근간이 될 수 있는 자료를 제시하고자 본 연구를 시행하여 다음과 같은 결과를 확인하였다

1. 순수 분리된 CD34**+ 세포(85.4 ± 3.4%)를 서로 다른 4가지의 조혈촉진인자 조합 하에 priming한 결과 1.5∼6.3배 증식되는 효과를 보였으며, cycling 세포 분획(S+G2/M) 또한 기저치와 비교시 약 2∼6배 증가되었다. 이는 특히 thrombopoietin (TPO)이 포함된 조혈촉진인자를 사용한 경우에서 보다 현저한 양상을 보였다.

2. 조혈촉진인자의 종류에 따른 조혈모세포의 면역표현형 변화에 있어서의 차이는 없었으며, TPO흑은 Flt3 ligand (FL) 투여가 CD34**+ 세포의 분화를 효과적으로 차단시키지는 못하였다. 다만, CD34**+AC133**+ 세포군은 TPO를 투여한 경우에서 보다 높게 유지되는

양상을 보였다.

3. △LNGFR retroviral vector의 역가는 5x10**5∼3×10**6 cfu/ml이었으며, △LNGFR 유전자 도입시 retronectin을 사용한 경우에서는 23.1 ± 4.4%로 사용하지 않은 경우(6.7 ± 2.3%)에 비해 4배의 형질도입 효과의 향상이 관찰되었다. 또한 retronectin을 사용하지 않은 경우에서는 TPO가 포함된 조혈촉진인자를 사용할 경우 형질도입률이 2배 상승되었던 반면, retronectin을 사용한 경우에서는 조혈촉진인자의 종류에 따른 형질도입 효과의 차이는 관찰되지 않았다.

4. △LNGFR유전자를 도입한 후 △LNGFR**+ 세포군의 선택적인 분리를 시행한 결과, 분리 전 △LNGFR**+ 세포분획이 6.7 ± 2.3%, 분리 후에는 86.3 ± 6.5%로 효과적인 분리가 가능하였다.

5. △LNGFR유전자 도입은 조혈모세포의 면역표현형 및 colony 형성능력에 영향을 주지 않았으며, △LNGFR**+ 세포군을 선택적으로 분리한 후 PCR을 시행한 결과 배양된 colony 중 85.0%에서 △LNGPR DNA band를 확인할 수 있었다.

6. 표지유전자 △LNGFR retroviral vector를 이용한 형질도입 효과의 측정은 기존의 drug selection 방법과 비교시 보다 빠르고 정확한 분석이 가능함을 확인할 수 있었다.

이상의 결과로 TPO가 포함된 조혈촉진인자의 사용은 조혈모세포의 증식 및 세포주기의 변화 유도에 있어서 효과적이며, retroviral vector를 이용한 조혈모세포로의 형질도입조건에 있어서 retronectin을 사용하는 것이 형질도입 효과를 보다 높일 수 있는 방법이었다. 또한 △LNGFR의 이용은 형질도입 효과를 48시간 이내에 빠르고 정확하게 측정할 수 있고 표적세포의 생물학적 성상에 영향을 주지 않으며 선택적 분리에 의한 원하는 단일세포군의 임상적 적용을 가능케 하는 유용한 방법임을 확인할 수 있었다. 이를 근간으로 향후 retroviral vector를 이용한 조혈모세포 유전자 치료를 계획함에 있어서 조혈모세포로의 형질도입 효과를 최적화시키기 위해서는 새로운 vector 개발, virus 역가를 보다 높일 수 있는 방법, vine와 조혈모세포간의 부착능력을 높일 수 있는 조건, 조혈모세포의 분화 및 사멸을 최소화하고 증식만을 선택적으로 유도할 수 있는 조건 등에 관한 지속적인 연구 ·검토가 필요할 것으로 생각된다.

[영문]

Primitive hematopoietic stem cells (HSC) are potential targets for treatment of numerous hematopoietic diseases using retroviral-mediated gene transfer. However, insufficient retroviral-mediated gene transfer to HSC and gene expression in

progeny cells derived from transduced HSC are two major problems associated with HSC-based gene therapy. This study was performed to evaluate the impact of different cytokine combinations including thrombopoietin (TPO) and recombinant flbronectin fragment (retronectin) during retroviral transduction of CD34**+HSC and to analyse the immunophenotypic and functional characteristics of transduced CD34**+HSC. Also, using a retroviral vector, containing the intracytoplasmatically truncated human low- affinity nerve growth factor receptor (△LNGFR) cDNA as a marker gene, the possibility of rapid and accurate quantitation of the transduction efficiency as well as selective isolation of transduced cells was evaluated. The results are summarized as follows:

1. The total number of CD34**+cells (1.5∼6.3-fold) and the amount of cycling (S+G2/M)cell fractions (2∼6-fold) were significantly increased after cytokine prestimulation for 48 hours, especially using TPO-based cytokine combinations.

2. FACS analysis of immunophenotype of CD34**+ cells showed no significant differences during cytokine prestimulation according to the type of cytokine combinations. However, CD34**+ Ac133**+ cell populations were more effectively maintained in the presence of TPO.

3. In the presence of retronectin, the transduction efficiency of CD34**+ cells was increased four-fold higher (23.1 ± 4.4% vs 6.7 ± 2.3%) and was not affected by the addition of TPO-based cytokines. However, TPO-based cytokines were able to increase the extent of gene transfer in the absence of retronectin.

4. Imnunomagnetic selection of the transduced cells with a monoclonal anti-△LNGFR antibody allowed us to enrich transducer cells effectively from 6.7 ± 2.3% to 86.3 ±6.5%.

5. Compared with control (non-transduced, mock-transduced) CD34**+ cells, △LNGFR trans-duction did not influence on the immunophenotype and cloning efficiency.

Among the △LNGFR**+ - derived colonies, 85.0% were shown to contain an integrated △LNGFR gene.

6. Similar pattern of results was obtained between △LNGFR FACS analysis and G4l8 selection method.

These data provide evidence that retronectin and TPO-based cytokines can be used to enhance the proliferation of CD34**+ HSC, and to facilitate retroviral transduction. Also,△LNGFR transduced cells could be rapidly quantitated and characterized by FACS analysis and efficiently enriched by immunomagnetic selection method. Further improvements of transduction conditions for stimulation of HSC proliferation without differentiation and development of new vectors that obviate the requirement for cell division are likely to further enhance transduction of primitive HSC.