사람의 난소 상피종양 세포주에서 all-trans-retinoic acid의 항암 효과와 apoptosis와의 연관성

Abstract

[한글]

상피성 난소 암종의 치료제로서는 대개 cisplatin이 쓰이는데 이러한 약제에 대해서 반응을 안 보이는 난소의 상피종양 세포주(NIH OVCAR3와 SKOV3)에서 retinoic acid(RA)가 다른 장기와 마찬가지로 항암 효과가 있는 지를 알아보고자 하였다. 각 종양 세포주에 all-tracts-retinoic acid(tRA)를 준 후, 세포 증식 억제 여부와 retinoic acid receptor(RAR)발현 정도를 알아보고 apoptosis의 발생 여부 및 apoptosis와 관련된 유전자인 p53, bcl-2, c-myc발현 여부를 관찰하여, 각 종양 세포주에 대한 RA의 항암 효과와 apoptosis와

의 관계 및 apoptosis와 활성화되는 유전자와의 관련성 여부를 알아보았다.

tRA의 농도는 10**-8 M 부터 10**-4 M 까지 주었으며 tRA를 주지 않은 군을 대조군으로 사용하였다. 세포의 증식 억제 여부는 세포를 trypan blue로 염색한 후에 hemocytometer를 이용하여 세포 수를 측정하여 관찰하였다. Apoptosis의 발생 여부 실험은 세가지를 하였는데 첫 번째로 hematoxylin-eosin염색을 한 후에 광학 현미경으로 형태를 관찰하였으며 apoptosis가 일어난 세포의 수를 세어 tRA의 농도에 따라 서로 비교하였다. 두 번째는 DNA 전기 영동을 시행하여 DNA 전기 영동 양상을 관찰하였고 세 번째로 유세포 검사를

시행하여 apoptosis의 정량 분석 및 세포 주기의 변화를 관찰하였다. RAR과 p53, c-myc, 그리고 bcl-2의 발현은 northern blotting을 이용하였다.

tRA는 두 세포주 모두에서 세포의 증식 억제를 일으켰으며 tRA의 농도가 높을수록 세포의 증식 억제도 심하게 나타났다. H&E염색과 유세포 검사, DNA gel 전기 영동법을 이용하여 apoptosis가 두 세포주 모두에서 일어났음을 확인하였으며 세포의 apoptosis로 인하여 세포의 증식 억제가 일어났음을 알 수 있었다. NIH OVCAR3세포주에서는 RARβ유전자와 bcl-2유전자의 발현이 있었으나 대조군에 비해서 tRA를 준 군에서 RARβ유전자와 bcl-2유전자의 발현의 차이는 없었고 RARγ유전자는 미약한 증가를 보였으며 p53유전자는 감소 소견을 보였다. c-myc과 RARα유전자의 발현은 두 군 모두에서 없었다. SKOV3세포주는 대조군에 비해서 tRA를 준 군에서 RARβ와 RARγ의 발현이 높게 나타났으며 bcl-2의 발현은 감소되었고 p53유전자의 발현은 증가되었다.

이상의 결과로서 tRA는 두 세포주에서 모두 apoptosis를 일으켰으며 세포의 증식 억제가 나타나 tRA의 두 세포주에 대한 항암 효과를 확인 할 수 있었다. 그러나 NIH OVCAa3세포주에서는 본 연구에서 이용한 apoptosis관련 유전자인 c-myc, bcl-2, p53유전자와 apoptosis와는 관련이 없게 나타나서 이러한 과정은 다른 유전자를 통해서 일어난 것으로 생각되며 또한 RARs 유전자와도 관련이 미약하여 RA의 다른 수용체인 retinoid X receptor(RXR)와 관련이 있을 것으로 여겨진다. 반면 SKOV3세포주인 경우에는 RARβ와 RARγ가 apoptosis를 일으키는데 역할을 하였으며 p53유전자와 bcl-2유전자가 apoptosis와 관련이 있는 것으로 사료된다.

[영문]

Ovarian carcinoma continues to be a serious life-threatening disease in women with a 5-year survival rate of 30∼40%. Some of the recent reports revealed that all-tracts-retinoic acid (tRA)inhibited the proliferation of ovarian carcinoma cell lines and induced apoptosis. Retinoids could mediate their inhibitory effects on cancer cell growth by interacting with two classes of nuclear retinoid receptors,

the retinoic acid receptors (RARs) and the retinoid X receptors (RXRs). The aim of this study was to evaluate the anticancer effect and inducing apoptosis of tRA on the ovarian epithelial carcinoma cell lines, NIH OVCAR3 and SKOV3. The changes of

expression of the RARα, β, γ, p53, bcl-2 and c-myc genes after treatment of tRA were also studied. The inhibitory effect of cell proliferation was observed using hemocytometer. In NIH OVCAR3 cell line, the number of cells was decreased significantly in proportion to the concentration of tRA. However, the number of

cells was decreased only at the concentration of tRA 10**-**4 M and 10**-**5 M in SKOV3 cell line. There was no inhibitory effect observed in other conditions. The morphologic changes of apoptosis were shown in the hematoxylin-eosin stain. After treatment of tRA, both cell lines showed characteristic apoptotic morphologic patterns, i.e., cell shrinkage, nuclear condensation, fragmentation of cytoplasm or nucleus, and the formation of apoptotic bodies, The number of apoptotic cells was also increased in proportion to the concentration of tRA. The DNA gel

clectrophoresis reveled the DNA ladder pattern, the hallmark of the apoptosis in the NIH OVCAR3 cell line. However, there was no DNA ladder pattern in SKOV3 cell line. The quantitative analysis and cell cycle analysis were done using flow cytometer. The percentage of apoptosis was significantly increased in proportion to tRA concentration in both NIH OVCAR3 and SKOV3 cell line. There was no change of cell cycle or Gl arrest in both cell lines. Finally expressions of RARs, bcl-2, c-myc and p53 gene were observed using northern blotting. There was no RARα expression in both cell lines. In NIH OVCAR3 cell line, there was no expression changes in RARβ and bcl-2 gene, the RARγ gene expression of tRA treated group was merely increased as compared with that of control group, p53 gene expression was decreased and c-myc gene was not expressed. In SKOV3 cell line, the expressions of RARβ and γ gene were increased in the tRA treated group, the c-myc gene was expressed but there were no changes between tRA treated and control group. The p53 gene expression was markedly increased and bc12 gene expression was decreased after treatment of tRA in SKOV3 cell line.

The result of this study suggests that tRA has anticancer effect and induces apoptosis on both cell lines. Among RARs, RARβ and RARγ were correlated to the anticancer effect of tRA on SKOV3 cell line. Bcl-2 and p53 genes were also correlated to tRA induced apoptosis in SKOV3 cell lines. However, in NIH OVCAR3

cell line, the genes were not correlated to anticancer effect and apoptosis of tRA.