성장판 연골세포의 시험관내 배양 방법에 따른 연골 세포의 표현형의 변화

Abstract

[한글]

골단 성장판 손상은 소아골절의 6-15%를 차지하며, 장관골의 성장판 손상으로 인하여 초래되는 골단축(bone shortening) 및 굴곡변형(angular deformity)은 임상적으로 여러가지 문제점을 야기시키고 특히 하지의 경우 이러한 성장장애로 인한 문제는 더욱 심각하다. 성장판 손상으로 인한 성장판의 조기 폐쇄에 대한 예방 및 적절한 치료는 아직까지 완전히 해결되지 않은 논제이다. 만족할 만한 정형외과적인 결과를 얻기 위해서는 두가지 조건을 충족시킬 수 있어야하는 데, 첫째는 골교 형성을 방지하여야하며, 둘째로 성장판의 기능을 수복시켜야 한다는 것이다. 위에서 언급한 2가지 조건을 만족시킬 수 있는 치료방법으로 성장판 이식과 성장판 연골세포의 이식이 가능성을 보여주고 있다. 성장판 이식은 공여자를 구하기 어려우며, 술기가 복잡하여 임상적으로 적용하기에는 많은 어려움

이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 반해 성장판 연골세포의 이식은 골교 형성에 의한 성장장애의 방지와 동시에 성장판의 재생을 유도할 수 있을 것으로 예상하고 있다. 그러나 배양세포를 아무런 전달자 없이 액상으로 이식할 때 세포의 손실이 많고, 세포의 배양 과정에서 연골세포의 표현형을 유지시켜야하는 문제가 있다. 따라서 본 연구에서는 배양세포의 손실을 최소화할 수 있는 세포 배양방법을 알아보고자 토끼 성장판 연골세포를 일차 배양후 단층 배양과 제1형 교원질 gel을 이용한 3차원 배양을 실시하고 다시 각군에서 TGF-β^^1을 투여한 군과 투여하지 않은 군으로 세분하여 시간경과에 따라 세포의 증식율, 제1형과 제2형 교원질 및 aggrecan의 mRNA의 변화를 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 제1형 교원질의 경우 배양 시간의 경과에 따라 mRNA의 변화가 없는데 반해 제2형 교원질은 배양 시간이 경과함에 따라 표현이 점점 약화되다가 배양 21일째에는 표현형이 소실되었다. Aggrecan도 역시 시간의 경과에 따라 표현이 약화되나 소실되지는 않았다.

2. 단층 배양군에서 TGF-β^^1 을 투여한 군이 투여하지 않은 군보다 세포가 증식되었다. 3차원 배양군은 TGF-β^^1 을 투여치 않은 군은 단층 배양군의 TGF-β^^1 을 투여치 않은 군과 비슷한 증가율을 보였으나 TGF-β1을 투여한 군은 세포증식율이 배양시간 경과에 따라 증가되지 않았다.

3. 제1형 교원질 mRNA의 표현은 단층 배양군에서 시간의 경과에 따라 증가하였으며 TGF-β^^1을 투여한 군은 감소하였다. 3차원 배양군도 시간에 따라 표현이 증가하였고 TGF-β1을 투여한 군은 더 증가하였다.

4. 제2형 교원질 mRNA의 표현은 3차원 배양군의 TGF-β^^1 을 투여한 군에서만 그 표현이 관찰되었고 시간의 경과에 따라 증가합을 관찰할 수 있었다.

5. Aggrecan mRNA의 표현은 단층배양의 군에서 TGF-β^^1 투여에 관계없이 소량 증가하였으며 3차원 배양군의 경우 단층 배양군에 비해 소량 증가하였고 TGF-β^^1 투여한 군은 더욱 증가하였다.

이상의 결과를 미루어 보아 성장판 연골세포 배양에서 TGF-β^^1 이 투여된 3차원배양 방법이 세포의 표현형을 유지시켜 주는 방법임을 관찰하였다. 따라서 이 실험을 통하여 성장판 연골세포를 적절한 시험관내 배양방법으로 배양시 인체에 유효한 이식 방법으로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

[영문]

The incidence of physeal fractures has been estimated to be from 6-to-15% among children's fracture. Focal lesions of the physis cause considerable morbidity in terms of angular deformity and shortening of the long bone. A variety of procedures has evolved to treat these problems from physeal injury but prevention methods and management have not yet been established. To solve the problems of growth plate injury, one must meet at least two requirements: the prevention of bone bridge formation, and the restoration of the growth plate functions of the limb. Physeal

transplantation was suggested for the treatment of physeal injury, but the technique was too complicated to be applied in clinical use. Both requirements could possibly be met by culturing chondrocytes and implanting them into the physeal defects. However, there are two limitations in the implantation of cultured cells into the defective physis. One is that when the cells are implanted in a liquid state, there is a lot of cell loss. The other limitation is that the chondrocytes cultivated in vitro are dedifferentiated into fibroblasts. In the present study, we intended to check the growth rates and phenotypic markers of chondrocytes in dedifferentiated cells cultivated under various conditions in order to establish a culture system capable of overcoming the above limitations.

1.The mRNA levels of typeⅡ collagen and aggrecan, which are the phenotypic markers of chondrocytes, were decreased by passing time in culture, while that of typeⅠ collagen was unchanged, as expected. Especially, the expression of typeⅡ collagen could not be detected on 21st day of culture.

2.In monolayer culture groups, the TGF-β^^1 treated group showed more cell proliferation than the group which was not treated with TGF- β^^1. In three-dimensional culture groups, the TGF-β^^1 treated group was less proliferative than the groups which were not treated with TGF- β^^1

3.In both monolayer culture groups and three-dimensional culture groups, the expression of typeⅠ collagen increased slightly by passing time in culture.

TGF-β^^1 depressed the expression of typeⅠ collagen in the monolayer culture group, but increased the expression of typeⅠ collagen in the three-dimensional culture group.

4.The expression of type Ⅱ collagen could be detected only in TGF- β^^1-treated cells cultured in three-dimensional gel for four or more days.

5.The mRNA level of aggrecan increased both in the monolayer culture groups and in the three-dimensional culture groups, and the more increase was detected in the three-dimensional culture groups. The addition of TGf-β^^1 increased the mRNA level of aggrecan in the three dimensional culture groups.

These results suggest that the number of the dedifferntiated chondrocytes can be efficiently expanded by culturing the cells in monolayer in the presence of TGF-β^^1 and that the phenotypes of chondrocyte can be restored by culturing the cells in three-dimensional gel containing TGF-β^^1. The application of semi-solid gel containing differentiated chondrocytes in physeal implantation should be further evaluated.