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위암세포주에서 Helicobacter pylori에 의한 Interleukin-8 생산

Title
위암세포주에서 Helicobacter pylori에 의한 Interleukin-8 생산
Other Titles
Helicobacter pylori-induced interleukin-8 production of gastric epithelial cells in vitro
Issue Date
1998
Publisher
연세대학교 대학원
Description
의학과/박사
Abstract
[한글] Helicobacter pylori(h.pylori)는 만성 B형 위염 및 위 십이지장 궤양의 일차적 발병 원인이며 최근 위암 및 위 림프종과도 깊은 연관성이 보고되고 있다. 그러나 H. pylori에 의한 위염 및 소화성 궤양의 병인기전은 잘 알려져 있지 않다. H. pylori 감염은 조직학적으로 위점막층에 중성구 및 단핵구의 침윤을 특징으로 하고 있으며 이런 염증 세포의 침윤이 점막조직의 손상과 궤양형성에 중요한 인자로 작용하리라 생각하고 있다. 한편 H. pylori에 감염된 생체 위점막 조직 및 시험관에 배양한 위암세포주에서 tumor necrosis factor alpha (TNFα), interleukin-1β(IL-1β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8)등 몇 가지 사이토카인의 생산이 보고되었으나 H. pylori의 어떤 표면요소가 상피세포에서 IL-8의 생산을 유도하는 지는 아직 명확히 밝혀져 있지 않다. H. pylori 감염시 점막조직으로 유도되고 활성화된 호중구와 단핵구는 protease, elastase (Nakamura 등, 1992) 또는 활성산소 라디칼(Suzuki 등, 1992) 등을 유리하여 조직손상을 유발한다. 따라서 이러한 염증세포의 침윤과 활성화를 유도하는 상피세포의 IL-8 생산을 억제할 수 있다면 비침습성인 H. pylori에 의한 위장관의 병태생리적인 변화를 차단할 수 있을 것이다. 그러나 IL-8 생산의 신호전달체계에 관한 기존의 연구는 대부분 단핵 거식 세포에서 이루어졌으며 상피세포 특히 H. pylori 감염이 동반되었을 때 상피세포의 IL-8 생산에 관계하는 신호전달체계에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 본 연구는 H. pylori에 의한 위암세포주의 IL-8 생산 유도 및 이를 조절하는 기전을 밝히기 위하여 위암세포주인 KATO Ⅲ와 AGS 세포주를 이용하여 H. pylori 또는 TNFα로 자극하였을 때 자극 시간과 농도에 따른 IL-8 생산 양상을 알아보며 H. pylori를 물리적 또는 화학적인 방법으로 처리 하였을 때 위암세포주의 IL-8 생산 반응의 변화를 조사하고자 하였다. 이와 함께 세포내 신호전달경로에 관여하는 것으로 알려진 몇 가지 대표적 인산화효소(kinase) 인 protein tyrosine kinase (PTK), protein kinase C (PKC), protein kinase A (PKA)와 protein phosphatase에 대한 억제제를 이용하여 H. pylori에 의한 위암세포주의 IL-8의 생산에 관여하는 신호전달경로를 알아보고자 하였다. H. pylori는 시간 및 세균수에 비례하여 AGS 및 KATO Ⅲ 세포주의 IL-8 생산을 유도하였다. H. pylori를 가열처리, 저온처리, 포르말린처리, 여과막처리 등 여러 가지 물리적 또는 화학적인 방법으로 처리하였을 때 위암세포주의 IL-8 생산이 현저히 감소함으로 보아 살아있는 H. pylori의 직접적인 세포 접촉이 위암세포주의 IL-8 생산에 필요함을 알 수 있었다. Protein kinase 억제제 및 protein phosphatase 억제제를 이용한 신호 전달 경로의 차단이 H. pylori에 의한 상피세포의 IL-8 단백 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여 cycloheximide, PTK 억제제인 herbimycin A, genistein PKC 억제제인 staurosporin, PKA 억제제인 calyculin A, protein phosphatase 억제제인 H89로 전 처치한 후 H. pylori와 TNFα에 대한 위암세포주의 IL-8 생산의 변화를 ELISA 및 RT-PCR로 비교 분석한 결과 H.pylori에 대한 위암세포주의 IL-8 생산은 PTK 및 PKC 억제제에 의해 억제되었으며 PKA 및 protein phosphatase억제제는 유의한 억제 효과를 보이지 않았다. 한편 TNFα에 의한 IL-8 생산도 H. pylori와 유사하게 PTK 및 PKC 억제제에 의해 감소되었으며 PKA 및 protein phosphatase 억제제에 의해서는 의의 있는 변화가 없었다. H. pylori 자극으로 위암세포주가 생산하는 TNFα가 세포주를 다시 자극함으로써 IL-8의 생산을 유도하였을 가능성을 확인하기 위하여 항 TNFα항체로 전처치 한 뒤 H. pylori로 자극시킨 결과 위암세포주의 IL-8 생산에 유의한 억제효과를 관찰할 수 없었다. 이상의 결과를 종합하면 살아있는 H. pylori의 직접적인 접촉이 위암세포주의 IL-8 생산에 필수적인 것을 알았으며 H. pylori에 의한 위암세포주의 IL-8 생산에는 TNFα에 의한 IL-8 생산과 유사하게 PTK와 PKC가 관여하지만 TNFα를 통하지는 않음을 알 수 있었다.
[영문] Helicobacter pylori (H. pylori) is the primary cause of type B gastritis and has been known as one of the etiologic factors of peptic ulcer diseases in human. The pathogenic mechanisms of H. pylori induced gastroduodenal mucosa injury have net been well clarified. H. pylori infection of the gastroduodenal mucosa is characterized by intense and persistent infiltration of inflammatory cells namely polymorphnuclear leukocytes and mononuclear cells. Production of interleukin-8 (IL-8) as well as several other cytokines such as interleukin-1β, interelukin-6, tumor necrosis factor alpha (TNFα by gastric epithelial cells had been reported both in vivo and in vitro. The production of IL-8 by gastric epithelium is an important step in the initiation and progression of mucosa inflammation with H. pylori infection. However, little is known of the signal transdution pathways as well as the bacteria to cell interactions resulting in IL-8 secretion by epithelial cells upon stimulation with H. pylori. The aims of the study were to evaluate the effects of bacterial status affecting IL-8 production of epithelial cells and to evaluate the overall view of the cellular signal pathways involved in IL-8 production of gastric epithelium. Two human gastric epithelial cell lines, AGS and KATO Ⅲ were co-cultured with H. pylori or exposed to TNFα. Various physical and chemical treatment of H. pylori were performed before the stimulation to assess the bacterial status required to induce IL-8 production by epithelial cells. After pretreatment with various inhibitors of protein kinases namely herbimycin A, staurosporin, genistein, calyculin A and H89, the IL-8 production was measured by ELISA and expression of IL-8 mRNA was confirmed by RT-PCR. In order to confirm the possible autologous stimulation of IL-8 production by TNFα secreted by epithelial cells, culture media containing epithelial cells were pretreated with blocking anti TNFα antibody before the stimulation by H. pylori. The results were as follows: Significant amount of IL-8 production of gastric epithelial cells was seen fellowing stimulation by TNFα or H. pylori in a dose and time dependent mode. Both epithelial cell lines showed some degree of constitutive IL-8 production without exogenous stimuli. Significant reduction in IL-8 production of epithelial cells were noted when H. pylori was treated with various physical and chemical methods; heating for 10 min, overnight cooling, 0.5% formaldehyde and blocking the direct bacterial to cell contact by cell insert (0.4μm pore size). The protein kinase A (PKA) inhibitor, H89 (10μM) had no effect on IL-8 production of AGS or KATO Ⅲ cells with H. pylori or TNFα stimulation. While protein kinase C (PKC) inhibitor, staurosporin (1μM) significantly inhibit the IL-8 poduction of AGS as well as KATO Ⅲ on H. pylori and TNFα stimulation. The protein tyrosine kinase (PTK) inhibitor, herbimycin A (30nM) or genistein (250μM) significantly inhibit the IL-8 production of both cell lines irrespective of stimulus; H. pylori or TNFα. The protein phosphatase inhibitor, calyculin A (25 nM) had no significant effects on IL-8 production. Similar inhibitory patterns of protein kinase inhibitors mainly PTK and PKC inhibitors on IL-8 production of gastric epithelial cells upon stimulation by with TNFα and H. pylori were noted. Pretreatment with anti TNFα antibody showed no significant effect on the IL-8 production of epithelial cells stimulated by H. pylori. In conclusions, at least two different protein kinases are involved in IL-8 production by AGS cells and KATO Ⅲ cell; PTK and PKC. A live bacterium with close adherence to epithelial cell is required for the IL-8 production. Pretreatment with anti TNFα antibody exclude the possibility of TNFα mediated autologous stimulation of IL-8 production of gastric epithelial cells induced by H. pylori. Further studies would be required to clarify the signal pathways regarding IL-8 production in H. pylori infection.
URI

http://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/125797
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2. 학위논문 > 1. College of Medicine (의과대학) > 박사
Yonsei Authors
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