Minocycline이 표피 각질형성세포의 증식 및 분화에 미치는 영향

Abstract

[한글]

Minocycline은 감염성 질환 이외에도 여러 가지 질환에서 광범위하게 치료효과를 나타내는데, minocycline이 뚜렷한 치료효과를 나타내는 대표적인 피부질환으로는 여드름, 주사, 괴저성 농피증, 급성 두창상 태선양 비강진, 지속성 수장 족저 농피증, 유천포창, 이 영양성 수포성 표피 박리증 등이 있으며, 이러한 질환에서 minocycline의 치료효과는 지금까지 밝혀진 minocycline의 항염증 작용 및 면역억제작용들로 설명할 수 있다.

최근들어 조직학적 소견상 염증을 동반하지 않으면서 표피에서 과각화증과 극세포증을 보이는 융합성 망상 유두종증(confluent and reticulated papillomatosis)의 치료에 minocycline이 가장 우수한 효과를 나타낸다는 보고가 나왔으나 지금까지 밝혀진 minocycline

의 약리작용으로는 융합성 망상 유두종증에 대한 치료효과를 설명할 수 없다. 따라서 연구자는 minocycline이 각질형성세포의 증식 및 분화에 어떤 영향을 미칠 것이라는 가정을 세웠으며 이를 증명하기 위해 본 연구를 하게 되었다.

본 연구에서는 사람 각질형성세포 단층배양과 인공표피배양을 시행한 후 minocycline을 투여하고 광학현미경 관찰을 통해 시간별 및 약물의 농도별로 형태학적 변화를 관찰하였다. 또한 minocycline이 각질형성세포의 증식에 미치는 영향을 살펴보기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 25-diphenyltetrazolium bromide(MTT)검사 ,5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)를 이용한 세포증식검사 및 proliferating cell nuclear antigen(PCNA)항체를 이용한 면역조직화학염색을 시행하였고, minocycline의 작용을 다른 항생제와 비교하기 위해 HaCaT 세포 배양액에 minocycline, gentamicin, penicillin, streptomycin, ampicillin을 투여한 후에 형태학적 변화를 비교 관찰하였다. 또한 minocycline이 각질형성세포의 분화에 미치는 영향을 살펴보기 위해 각질형성세포의 분화 표지자로 사용되는 involucrin, filaggrin과 keratin 10, keratin 5/8, keratin 14에 대한 단클론 항체를 이용한 면역조직화학염색과 면역블롯팅검사를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

Minocycline이 각질형성세포의 증식에 미치는 영향을 살펴본 결과 첫째, 형태학적 연구상 단층세포배양에서는 minocycline 농도가 20 ㎍/ml에서부터, 인공표피배양에서는 30㎍/ml에서부터 각질형성세포의 증식을 억제하였다. 둘째, MTT검사 결과 각질형성세포인 경우 minocycline농도가 20 ㎍/ml일 때, HaCaT 세포인 경우 30 ㎍/ml일 때 세포 증식을 억제하기 시작하였다. 셋째, BrdU를 이용한 세포증식검사 결과 minocycline 농도가 15 ㎍/ml일 때 세포 증식을 억제하기 시작하였다. 넷째, PCNA 면역조직화학염색 결과 minocycline 농도가 30 ㎍/ml에서는 기저층과 기저층 상부 한층까지만, 약물농도 60 ㎍/ml에서는 기저층에서만 염색되어 대조군에 비해 뚜렷한 감소를 보였다. 다섯째, minocycline의 증식억제 작용을 다른 항생제와 비교해 본 결과 minocycline은 혈장내 치료농도의 약 5배인 20 ㎍/ml의 농도에서부터 뚜렷하게 HaCaT 세포의 증식을 억제한 반면, gentamicin은 혈장내 치료농도의 약 10배인 50 ㎍/ml의 농도까지, penicillin과 streptomycin은 각각 혈장내 치료농도의 약 30000배, 60배인 3000 unit/ml, 3000 ㎍/ml의 농도까지, ampicillin은 혈장내 치료농도의 약 50배인 300 ㎍/ml의 농도까지 전혀 증식억제작용이 나타나지 않았다.

Minocycline이 각질형성세포의 분화에 미치는 영향을 살펴본 결과 첫째, 형태학적 연구상 인공표피에서 약물농도 30 ㎍/ml에서부터 과립층과 각질층의 감소가 뚜렷하게 관찰되었다. 둘째, 분화 표지자를 이용한 면역조직화학염색상 약물농도 30 ㎍/ml에서부터 involucrin, filaggrin, keratin 10에 염색되는 세포층이 감소되었고, keratin 14와 keratin 5/8에 염색되는 세포층의 비율은 대조군에 비해 상대적으로 증가하였다. 셋째, 분화 표지자를 이용한 면역블롯팅검사상 약물을 투여한 실험군에서는 약물농도가 증가함에 따라 involucrin의 양은 감소하였고, keratin 5/8의 양은 증가하였다.

이상의 결과로 보아 minocycline이 각질형성세포의 증식 및 분화를 동시에 억제함을 알 수 있었고, 이러한 약리작용 때문에 minocycline이 융합성 망상 유두종증에 치료효과가 있는 것으로 생각된다.

[영문]

Minocycline is one of the most widely used antibiotics in dermatology. In addition to the infectious conditions, it also has been used in the treatment of various noninfectious dermatologic diseases, including acne, rosacea, pyoderma

gangrenosum, prurigo pigmentosa, pityriasis lichenoides et varioliformis acute, pustulosis palmaris and p1antaris, bullous pemphigoid, and dystrophic epidermolysis bullosa.Pharmacologic mechanisms of minocycline in these disorders can be explained by its anti-inflammatory effects, such as inhibition of neutrophil chemotaxis and its immunosuppressive properties.

However, minocycline has been proved to be the most effective drug in confluent and reticulated papillomatosis (CRP) which is characterized by hyperkeratosis, acanthosis, and papillomatosis without any evidence of infection, inflammation, and immune-dysfunction. The mechanism of action of minocycline in this disease can not be explained by its many properties which is already known, such as antibacterial, anti-inflammatory, and immunosuppressive effects. Therefore, we evaluated the effect of minocycline on proliferation and differentiation of keratinocytes.

Human normal keratinocytes, obtained from the circumcision of newborn foreskin, were grown by monolayer culture assay and living skin equivalent (LSE). Minocycline was dissolved in distilled water before use, and added to cell culture in a concentration from 5 ㎍/ml to 80 ㎍/ml. Morphologic analysis, MTT test, ELISA by BrdU, and immunohistochemical stain by proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were performed to evaluate the proliferation of keratinocytes treated by minocycline. In addition, morphologic analysis was performed to compare with various antibiotics using HaCaT cells after treatment of minocycline, gentamicin, penicillin, streptomycin, and ampicillin. We also performed morphologic analysis, immunohistochemical stains and immunoblotting by various differentiation markers of keratinocytes, such as involucrin, filaggrin, keratin 10, keratin 5/8, and keratin 14, to evaluate the differentiation of treated keratinocytes. The results are as

follows:

1. Effect of minocycline on proliferation of keratinocytes

(1) In monolayer culture assay, minocycline-treated keratinocytes showed decreased cell volume as well as loss of intercelluar attachment and normal polygonal morphology at a concentration of 20 ㎍/ml of minocycline. In LSE culture assay, the whole thickness of treated epidermis was decreased at a concentration of 30 ㎍/ml of minocycline.

(2) In MTT test for keratinocytes, cell growth rate was significantly decreased at a concentration of 20 ㎍/ml of minocycline. In MTT test for HaCaT cells, cell growth rate was significantly decreased at a concentration of 30 ㎍/ml of minocycline.

(3) In ELISA by BrdU for HaCaT cells, cell growth rate was significantly decreased at a concentration of 15 ㎍/ml of minocycline.

(4) The expression of PCNA was decreased at a concentration of 30 ㎍/ml of minocycline.

(5) In morphologic analysis using HaCaT cells after treatment of minocycline, gentamicin, penicillin, streptomycin, and ampicillin, the inhibition of growth was found only in the minocycline-treated HaCaT cells.

2. Effect of minocycline on differentiation of keratinocytes

(1) In LSE culture assay, the horny and granular layers were markedly decreased at a concentration of 30 ㎍/ml of minocycline.

(2) Minocycline decreased the expression of differentiation markers, such as involucrin, filaggrin, and keratin 10 at a concentration of 30 ㎍/ml. The expression of basal keratin, such as keratin 14 and keratin 5/8, was increased in the presence of minocycline at a concentration of 30 ㎍/ml.

(3) Immunoblotting using antibodies specific for differentiation markers showed decreased expression of involucrin and increased keratin 5/8 in the presence of minocycline.

These results suggest that minocycline has a direct inhibitory effect on both proliferation and differentiation of human normal keratinocytes. Therefore, the therapeutic efficacy of minocycline for CRP may be due to this effect.