간장세포에서 백서 간장형 포도당운반체 유전자의 promoter와 전사인자들과의 상호작용

Abstract

[한글]

세포 분화는 개체 내에서 엄격하게 조절되는 생물학적 현상이며 조직 특이 유전자의 발현 조절과 밀접하게 관련되어 있다. 간장세포는 간장의 부분절제 또는 일차배양 등을 통하여 증식 또는 역분화 상태로 유도할 수 있으므로 조직 특이 유전자 조절과 세포 분화에 대한 연구에 적합하며, albumin 유전자 등을 이용하여 현재까지 많은 연구가 진행되어 왔다. 간장세포는 포도당 대사의 중심 장기이며 그 기능 수행을 위해 간장형 포도당운반체를 발현시키고 있는데, 이 포도당운반체는 한정된 조직 분포를 보이고 있을 뿐 아니라 그 유전자 발현이 세포 분화와 밀접하게 연관되어 있는 것으로 보인다. 간암 세포주와 일차배양세포 등에서 이 포도당운반체의 전사가 매우 억제되는 현상을 볼 수 있으며, 이는 이 유전자의 발현이 분화과정과 연관되어 있음을 시사하고 있다. 따라서 본 연구에서는 간장형 포도당운반체 유전자의 promoter에 결합하는 전사인자를 밝히고, 특히 분화와 관련되어 간장세포에서 특이적으로 유전자가 발현되는데 중요한 전사인자의 역할을 밝히려 하였다.

백서 간장형 포도당운반체 유전자 promoter를 약 300 bP 크기를 가지는 DNA 조각으로 나누고 간장의 핵단백질을 이용하여 DNase I footprinting 실험을 한 결과 모두 8개의 전사인자 결합 부위를 확인하였으며, 각각 Box Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ-1, Ⅲ-2, Ⅲ-3, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ라 이

름하였다. 또 이들 부위를 신장 및 비장의 핵단백질을 이용한 footprint와 비교하였을 때 3개 부위(BoxⅡ, Box Ⅳ, Box Ⅵ)에서 차이를 보여 이들 부위는 간장세포에 특이한 전사인자가 결합할 것으로 생각되었다. 따라서 이미 알려진 간장세포 특이 전사인자들의 결합부위들을 double stranded oligonucleotide로 제조하고, 이를 DNase I footprinting 실험 또는 electrophoretic mobility shift assay에 competitor로 첨가하여 competition assay를 시행하였으며, 그 결과로 BoxⅡ에는 hepatocyte nuclear factor(HNF)-3와 HNF-5가, B

ox Ⅳ와 Box Ⅵ에는 CCAAT/enhancerbinding protein(C/EBP)이 결합함을 알 수 있었다. 또한 각각의 C/EBP isotype에 대한 항체를 이용한 supershift assay를 통하여 이들 부위에 C/EBPα와 C/EBPβ가 결합하고 있음을 확인하였다.

간장형 포도당운반체는 정상 간장에서 발현되지만, 간암 세포주나 간장세포 일차배양 등에서 발현이 억제되는 것으로 알려져 있다 그러므로 일차배양한 간장세포에서 C/EBP와 같은 간장세포 특이 전사인자와 promoter 간 상호작용의 변화 유무에 대하여 조사한 결과

, 세포 배양 1시간에서 4시간 사이에 Box Ⅳ 및 Box Ⅵ와 C/EBP의 결합이 급격히 감소하였다. 또한 이런 결합력의 변화는 C/EBPα나 C/EBPβ의 양적 변화와 일치하지 않았으므로, 단백질 양의 변화 뿐 아니라 단백질의 인산화 등이 결합력에 영향을 주는 것으로 보인다.

C/EBP 전사인자가 promoter 활성에 주는 영향을 직접적으로 관찰하기 위하여 간암 세포주인 HepG2에서 C/EBPα와 C/EBPβ를 과발현시키고 Promoter의 활성을 chloramphenicolacetyltransferase assay를 이용하여 조사한 결과, 이들 전사인자들이 Box Ⅳ와 Box Ⅵ에

상승적(synergic)으로 작용하여 CAT 활성을 크게 증가시켰으며, 이러한 현상은 Box Ⅵ에서 더욱 크게 나타났다. 따라서 간장형 포도당운반체 유전자 promoter에는 HNF-3 혹은 HNF-5, C/EBP와 같은 전사인자가 결합하고, 특히 C/EBP 전사인자는 간장형 포도당운반체 유

전자 promoter에 결합하여 분화과정 뿐만 아니라 생체 내 정상 간장세포에서 이 유전자의 발현에 중요한 역할을 할 것으로 보이며, 간장세포의 일차배양 또는 간암세포와 같이 세포의 분화양상이 달라지는 경우 이 유전자의 발현이 억제되는 기전에도 관여할 것으로 생각된다.

[영문]

The interaction between the transcription factors and the rat GLUT2 gene promoter was investigated to understand the mechanism involved in the tissue-specific expression of GLUT2 in hepatocyte. DNase I footprinting assay using crude liver nuclear extract clearly showed eight protected sites within -500 bp region, hence named BoxⅠ, Ⅱ, Ⅲ-1, Ⅲ-2, Ⅲ-3, Ⅳ, Ⅴ, and Ⅵ. Three liver-specific sites were identified by comparing the protected regions using various nuclear extracts from different tissues. Electrophoretic mobility shift assay with competition revealed that HNF-3 binds to Box Ⅱ(-120∼-70), and C/EBP binds to both Box Ⅳ(-375 ∼-356) and Box Ⅵ(-5000∼_471). Supershift experiment showed that C/EBPα and C/EBPβ bind to the BoxⅣ and Box Ⅵ.

GLUT2 expression is known to be suppressed in cultured cell line such as HepG2, as well as pimary cultured hepatocytes. To clarify the role of C/EBP responsible for this phenomenon, EMSA using time-course nuclear extract during primary hepatocyte culture was done. The binding of C/EBP to Box Ⅳ and Box Ⅵ were dramatically reduced within 4 hrs after culture, suggesting that C/EBP may be responsible for the decreased expression of GLUT2 during primary cultured hepatocytes. In addition, the Box Ⅵ-CAT(chloramphenicol acetyltransferase) construct was activated by C/EBPα and C/EBPβ overexpression in HepG2 cells, suggesting that C/EBP is the main regulator of GLUT2 expression in liver. These results indicate that C/EBP may be responsible for the liver-specific expression of GLUT2 which is developmentally controlled.