한삼덩굴(Humulus japonicus) 꽃가루 주알레르겐의 동정 및 특성 연구

Abstract

[한글]

한삼덩굴 꽃가루는 우리나라를 위시한 동북아시아에서 가을철 꽃가루 질환을 유발하는 알레르겐의 하나로 알려져 있다. 그러나 아직까지 한삼덩굴 꽃가루의 주알레르겐이 규명되지 않았다. 본 연구에서는 먼저 한삼덩굴 꽃가루의 주알레르겐을 밝히고, 주알레르겐의 생화학적특성을 규명하며 주알레르겐을 순수 분리하고자 하였다. 먼저 서울지역의 야외에서 한삼덩굴의 꽃가루를 채취한 후 이를 동결 건조하여 한삼덩굴 조항원을 제조하였고 이를 본 연구에 이용하였다. 한삼덩굴 꽃가루 조항원의 분획은 reducing SDS-PAGE법으로 분석하였고 한삼덩굴 꽃가루에 감작된 47 검체의 환자 혈청을 이용하여 IgE immunoblot 과 ELISA법으로 한삼덩굴 꽃가루 특이 IgE를 측정하였으며 이들 자료를 기초로 주알레르겐을 결정하였다. 동정된 주알레르겐의 특성 연구를 위해서 lectin blotting 분석, 2-dimensional SDS-PAGE/lgE immunoblot 법을 실시하였고 또 주알레르겐의 N-말단 아미노산의 순서결정은 Edman degradation법을 이용하였다. 주알레르겐의 분리를 위해서 DEAE 크로마토그래피와 FPLC 겔 여과 크로마토그래피를 실시하였으며 추출된 주알레르겐의 항원성은 한삼덩굴 특이 IgE ELISA 억제 실험으로 측정하였다. 그 결과는 다음과 같다. 한삼덩굴 아토피환자 47예의 혈청으로 시행한 IgE immunoblot 검사상 22 검체에서 13, 16, 20, 29, 42 kd등 5개의 항원에 대한 특이 IgE를 관찰할 수 있었다 이중 13 kD항원이 22 검체중 68%에서 IgE와 결합함으로써 관찰빈도가 가장 높았다. 한삼덩굴 꽃가루 특이 IgE ELISA 검사 결과를 보면, immunoblot 양성인 아토피군 (n=22)의 한삼덩굴 조항원 특이 IgE 흡광도가 0.345 (0.113∼1.055)로 피부반응검사 양성이지만 immunoblot 음성반응을 보인 군 (n=25)의 흡광도 0.049(0.018∼0.132) 와 비아토피군 (n=11)의 흡광도 0.003 (0.001∼0.010)에 비해서 유의하게 높은 값이 관찰되었다 (p<0.001). Lectin blot 분석 결과 한삼덩굴 조항원의 주알레르겐은 ConA를 위시한 6가지의 lectin과 결합하지 않았으며 PAS 염색에도 음성 이였다. 2-Dimensional SDS-PAGE/lgE immunoblotting상 13 kD 주알레르겐의 pl 값은 약 5.1 이었으며, 이 주알레르겐의 N-말단 아미노산 순서를 20번째까지 결정할 수 있었다. 한삼덩굴 꽃가루 조항원내 13 kD 주알레르겐은 DEAE 겔과 결합하지 않았으며 DEAE 겔에 비결합된 항원 분획으로 FPLC 겔 여과 크로마토그래피를 시행하여 13 kD 주알레르겐을 분리할 수 있었다. 한삼덩굴 꽃가루 조항원과 추출된 13 kD 항원으로 양성 표준혈청과 반응시켜 실시한 ELISA 억제시험에서 한삼덩굴 꽃가루 조항원과 13 kD 항원은 한삼덩굴 꽃가루 특이 IgE를 각각 용량의존적으로 99% 그리고 96% 까지 억제시켰으며 8번 분획의 ID^^50 농도는 한삼덩굴 꽃가루 조항원의 ID^^50 농도의 15%에 불과하였다.

이상의 결과를 종합하여 보면 한삼덩굴 꽃가루의 여러 항원중 주알레르겐은 reducing SDS-PAGE상 분자량이 13 kD항원이었다. 이 13 kD 주알레르겐은 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피와 FPLC 겔 여과 크로마토그래피에 의해서 비교적 순수하게 분리되었으며, 이는 lectin과 결합하지 않았고, pI값은 5.1이었으며, 20번째까지의 N-말단 아미노산의 배열이 규명되었다.

[영문]

Pollen of Humulus japonicus has been blown as one of important causes of pollenosis in Korea and China. To date, major allergens of Humulus japonicus have not been determined. This study aimed to identify the major allergen of Humulus japonicus and characterize the biochemical properties of the determined major allergen. Allergenic components of H. japonicus were separated by means of reducing SDS-PAGE. With the sera of patients reactive to H. japonicus (n=47), H. japonicus specific IgE was determined by immunoblotting and ELISA. Major allergen of H.japonicus was determined from the results of immunoblotting and ELISA inhibition test. The biochemical properties of major allergen of H. japonicus were characterized by pectin blowing assay and 2-dimensional SDS-PAGE/IgE immunoblot. N-terminal amino acid sequences were determined by Edman degradation method. With DEAE anion exchange chromatography and FPLC gel filtration chromatography, 13 kD allergen was purified. Twenty two sera contained the IgE bound to 13, 16, 20, 29, 42 kD proteins of H. japonicus in immunoblot analysis. A protein of 13 kD was the most prevailing allergen in sera of H. japonicus reactive patients (68%). Maximum inhibitions of H. japonicus specific IgE ELISA by both crude antigen of H. japonicus and purified 13 kD allergen were more than 95%, but the lD^^50 (50% inhibitory dome) of purified 13 kD allergen was 6.7 times lower than that of crude extract of H.japonicus. The geometric mean value of ELISA optic density of H.japonicus specific IgE in immunoblot positive subjects (n=22) was 0.345 (0.113∼1.055) which was signifcantly higher than that of skin prick test positive but immunoblot negative subjects [0.049 (0.018∼0.1320), p<0.001, n=25] and nonatopic subjects [0.003(0.001∼0.010), p<0.001, n=11]. The 13 kD allergen was neither stained with PAS nor bound with ConA and other 5 lectins. The isoelectric point of 13 kD allergen was approximately 5.1. With N-terminal micro-sequencing, sequence of N-terminal twenty amino acid of 13 kD allergen was determined. The major allergen of H. japonicus did not bind with DEAE gel. So the 13 kD allergen could he purified by FPLC gel filtration chromatography after the sample was passed through DEAE gel column.

These results suggest that the 13 kD peptide would be a major allergen of H. japonicus. Its isoelectric points was approximately 5.1 and the N-terminal amino acid sequences of the major allergen were determined. The 13 kD allergen could be purified from H. japonicus crude antigen by the DEAE anion exchange and FPLC gel filtration chromatography.