High expression of liver stem/progenitor cell markers, transforming growth factor-β signal and epithelial mesenchymal transition-related genes in scirrhous hepatocellular carcinoma

Abstract

[한글]최근 암줄기세포가 암종의 불량한 예후 및 치료 저항성에 관여하며, 상피간엽전환 (epithelial mesenchymal transition)이 암줄기세포의 발생을 촉진함이 보고되었다. 또한 상피간엽전환은 종양세포의 혈관 침입 및 전이에 중요하며, 전환성장인자 베타 (transforming growth factor-β, TGF-β)가 상피간엽전환에 중요한 유전자로 알려져 있다. 전형적인 간세포암종은 섬유성 간질조직의 형성이 거의 없는 것이 특징이고, 종양세포 사이에 섬유성 간질의 형성이 풍부한 조직학적 소견을 보이는 경우 경화성 간세포암종이라 하며, 그 임상병리학적 의의는 아직 확실히 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 경화성 간세포암종의 병리학적 특성을 밝히고자, 수술전 치료없이 절제된 경화성 간세포암종 19예를 대상으로 임상병리학적 소견, 간줄기세포 표지자 [EpCAM, CD133, keratin 19 (K19), K7, CD56, alpha-fetoprotein (AFP)], 간세포분화 표지자 (Hep Par 1), TGF-β 신호 물질(TGF-β, TGF-β Receptor I, TGF-β Receptor II, Smad4)과 상피간엽전환 관련 유전자 (Snail, Twist)의 발현을 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 및 면역조직화학 염색으로 검색하여 전형적인 간세포암종 (24예)과 비교 검색하였다.

경화성 간세포암종은 전형적인 간세포암종에 비하여 섬유성 간질조직 형성 (p<0.0001), 종양세포의 미세혈관 침범 (p=0.004) 및 문맥혈관침범 (p=0.047), 간내 전이 (p=0.044)가 의의있게 높았으며, 종양피막의 형성 (p<0.0001)은 더 낮았다. 간줄기세포 표지자 (EpCAM, K19, K7, CD56, AFP)에 대한 최근 암줄기세포가 암종의 불량한 예후 및 치료 저항성에 관여하며, 상피간엽전환 (epithelial mesenchymal transition)이 암줄기세포의 발생을 촉진함이 보고되었다. 또한 상피간엽전환은 종양세포의 혈관 침입 및 전이에 중요하며, 전환성장인자 베타 (transforming growth factor-β, TGF-β)가 상피간엽전환에 중요한 유전자로 알려져 있다. 전형적인 간세포암종은 섬유성 간질조직의 형성이 거의 없는 것이 특징이고, 종양세포 사이에 섬유성 간질의 형성이 풍부한 조직학적 소견을 보이는 경우 경화성 간세포암종이라 하며, 그 임상병리학적 의의는 아직 확실히 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 경화성 간세포암종의 병리학적 특성을 밝히고자, 수술전 치료없이 절제된 경화성 간세포암종 19예를 대상으로 임상병리학적 소견, 간줄기세포 표지자 [EpCAM, CD133, keratin 19 (K19), K7, CD56, alpha-fetoprotein (AFP)], 간세포분화 표지자 (Hep Par 1), TGF-β 신호 물질(TGF-β, TGF-β Receptor I, TGF-β Receptor II, Smad4)과 상피간엽전환 관련 유전자 (Snail, Twist)의 발현을 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 및 면역조직화학 염색으로 검색하여 전형적인 간세포암종 (24예)과 비교 검색하였다.

경화성 간세포암종은 전형적인 간세포암종에 비하여 섬유성 간질조직 형성 (p<0.0001), 종양세포의 미세혈관 침범 (p=0.004) 및 문맥혈관침범 (p=0.047), 간내 전이 (p=0.044)가 의의있게 높았으며, 종양피막의 형성 (p<0.0001)은 더 낮았다. 간줄기세포 표지자 (EpCAM, K19, K7, CD56, AFP)에 대한 면역염색 결과 경화성 간세포암종의 26.3~94.7% 및 전형적인 간세암종의 4.2~50%에서 양성발현을 보여, 경화성 간세포암종에서 간줄기세포 표지자의 발현이 의의 있게 높았다 (p<0.05). 또한 경화성 간세포암종에서는 EpCAM, K19, CD133, Oct3/4, cMET의 mRNA발현이 전형적인 간세포암종에 비하여 의의있게 높았다 (p<0.05). 반면 간세포 분화의 표지자인 Hep Par 1는 경화성 간세포암종에서 68.4%, 전형적인 간세포암종에서 100% 발현되어, 경화성 간세포암종에서 더 낮게 발현되었다 (p<0.05). TGF-β 신호 물질 (TGF-β, TGF-β Receptor I, TGF-β Receptor II, Smad4) 및 상피간엽전환 관련 유전자 (Snail, Twist)의 mRNA발현은 모두 경화성 간세포암종에서 전형적인 간세포암종 보다 의의 있는 증가를 보였다 (p<0.05). 이중면역조직화학염색으로 간줄기세포 표지자와 Snail의 발현양상을 검색하였다. 간줄기세포 표지자는 섬유성 간질과 맞닿은 종양세포 군집의 변연부에서 발현하는 경향을 보였으며, 대부분의 경우 (69%)에서 상피간엽전환의 핵심 인자인 Snail과 함께 발현되었다. 환자의 추적관찰 결과 경화성 간암종은 전형적인 간세포암종에 비하여 의의있게 높은 재발율을 보였다 (P=0.030). 이상의 소견으로 경화성 간세포암종은 간줄기세포 표지자의 발현, 상피간엽전환 및 TGF-β 신호의 발현증가로 침습적인 병리생물학적 특성 및 불량한 예후를 보이는 것으로 생각되며, 이러한 특성을 근거로 경화성 간세포암종은 단순히 간세포암종의 조직학적 소견의 하나가 아니라, 간세포암종의 특징적인 아형으로 분류하는 것이 좋을 것으로 생각한다.

[영문]Recently cancer stem cell has been reported to be involved in the chemo-resistance and poor prognosis of cancer patients. Epithelial mesenchymal transition (EMT), which is important in vascular invasion and metastasis of cancer, has been reported to induce cancer stem cell and a fibrogenic cytokine transforming growth factor-β (TGF-β) has been reported to induce EMT during tumorigenesis. Scirrhous hepatocellular carcinoma (HCC) is characterized by abundant fibrous stroma between tumor trabeculae, whereas the fibrous stroma is usually very little in classical HCC. Scirrhous HCC has been considered as one of histological patterns of HCC and its clinicopathological significance remains unclear. In this study, we selected 19 cases of resected scirrhous HCC (>60% of fibrous stroma of tumor volume) without pre-operative treatment and 24 cases of classical HCCs as a control group. The clinicopathological features, the expression of liver stem/progenitor cell markers [epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), keratin (K) 19, K7, CD56, CD133, Oct3/4, cMET and alpha fetoprotein (AFP)], hepatocyte marker (Hep Par 1), TGF-β signal pathway [TGF-β, TGF-β receptor I (TGFβRI), TGF-β receptor II (TGFβRII) and Smad4], and EMT-related genes (Snail and Twist) were investigated in scirrhous HCCs and classical HCCs by real time quantitative PCR and immunohistochemical stain and compared between two groups.Scirrhous HCCs showed significantly higher incidence of microvascular invasion (p=0.004), portal vein invasion (p=0.047) and intrahepatic metastasis (p=0.044), and significantly lower incidence of tumor capsule formation (p<0.0001) compared to classical HCCs. The incidence of positive expression of liver stem/progenitor cell markers (EpCAM, K19, K7, CD56, and AFP), detected by immunohistochemical stain, was 26.3~94.7% in scirrhous HCCs in contrast to 4.2~50% in classical HCCs, and the mRNA levels of EpCAM, K19, CD133, Oct3/4, and cMET were significantly up-regulated in scirrhous HCCs than in classical HCCs (p<0.05). The expression rate of hepatocyte marker (Hep Par 1) was low in scirrhous HCCs (68.4%) compared to classical HCCs (100%) (p<0.05). The mRNA levels of TGF-β signal pathway (TGF-β, TGFβRI, TGFβRII, Smad4) and EMT related genes (Snail and Twist) were significantly up-regulated in scirrhous HCCs compared to classical HCCs (p<0.05). The tophographical expression pattern of liver stem/progenitor cell markers (EpCAM and K19) and Snail was evaluated by double immunohistochemical stain. The expression of liver stem/progenitor cell markers was mainly detected in the periphery of tumor cell nests, facing the fibrous stroma and most of them (69%) showed co-expression of Snail. The tumor recurrence was significantly higher in scirrhous HCCs (52.6%) than in classical HCCs (20.8%) during the mean follow up of 18 months (p=0.030). In conclusion, scirrhous HCC is suggested to be a distinctive subtype showing invasive and aggressive clinicopathological characteristics, in which EMT, up-regulated TGF-β pathway and induction of liver stem/progenitor cell markers are involved.