A new fixative for molecular pathologic evaluation

Abstract

[한글]

연구목적: 포르말린은 가격이 저렴하고 고정한 조직의 형태를 그대로 잘 유지하여 고정액으로 가장 많이 사용되고 있다. 그러나 포르말린은 cross-linking작용으로 인해 고정한 조직의 macromolecule (DNA, RNA, protein)을 손상시킬 수 있다. 이 연구의 목적은 포르말린과 거의 유사한 수준의 형태적 소견을 유지하고 동시에 임상에서 필요로 하는 각종 특수화학 염색과 면역조직 화학염색뿐 만 아니라 분자생물학적 검사를 시행하는데 아무 이상이 없는 이상적이고, 안전한 새 고정액을 개발하는 것이다.

방 법: 알코올 계통의 각종 고정액을 비교 분석하여 친환경적이고 비독성인 고정액 (WONFIX)을 개발한 후, 쥐 조직과 인체 조직을 대상으로 다른 고정액과 비교하였다. Frozen tissue와 5개의 서로 다른 고정액 (1.WONFIX 2.Carnoy’s fixative 3.Methacarn 4.Wolman’s solution 5.Formalin)을 선택하여 각각의 고정액에 조직을 24시간 고정시킨 후 파라핀에 포매하였다. 광학현미경을 이용하여 고정액 별로 조직의 형태양상을 평가한 후 각 형태소견의 질을 A~E급으로 구분하여 판독하였고, 면역조직화학 염색을 시행하여 항원 발현 양상도 비교하였다. 고정한 조직의 파라핀 블럭에서 각각 DNA, RNA, protein을 추출한 후 macromolecule의 농도를 비교하고 Wilcoxon signed rank test방법으로 통계학적 유의성을 비교하였다. Housekeeping gene에 관하여 PCR, real-time PCR, Western blot analysis를 함께 시행하였다.

결 과: 신선 조직과 다섯 가지 고정액에 고정한 조직의 현미경적 소견에 관한 평가는 포르말린에 고정한 조직이 가장 우수한 형태를 보였고, 그 다음으로 WONFIX가 좋은 조직학적 형태를 유지하였다. 14개의 항체를 이용하여 시행한 면역조직화학 염색 결과는 양성과 음성발현빈도는 같았으나, WONFIX에 고정한 조직에서의 염색강도가 제일 강하였고 포르말린에 고정한 조직과 거의 유사한 양상을 보였다. 추출된 DNA의 양은 WONFIX에 고정한 조직 경우 가장 많았고 (p<0.05), β-actin에 관하여 PCR를 시행하였을 때 1,5Kb까지 PCR이 가능했다. 추출된 RNA 양은 WONFIX고정액을 이용한 경우 네 번째로 많았고, 포르말린에서 추출한 것보다 유의하게 많았다 (p<0.05). Real-time PCR을 시행하여 얻은 평균 threshold cycle number (CT) 값을 보면, 신선조직은 11.3, WONFIX는 12.3였다. 1000개의 세포를 microdissection하여 추출한 RNA를 이용하여real-time PCR를 시행한 후 평균 CT 값을 구한 결과, 신선 조직은 19.4, WONFIX는 23.2, 포르말린은 30.6로 WONFIX에 고정한 조직의 RNA가 다른 고정액보다 보존상태가 더 좋았다. Western blot analysis를 시행하여 단백질의 질을 비교한 결과 WONFIX에 고정한 조직에서 추출한 단백질은 신선한 조직에서 추출한 것과 비슷한 수준으로 상태가 좋았다.

결 론: WONFIX는 에탄올을 기반으로 개발된 고정액으로 중금속이나 유독한 화학물질을 포함하지 않은 친환경적이고 안전한 고정액이다. 동시에 형태학적 소견이 우수한 점이 특징이며 임상적으로 필요한 분자생물학적 검사를 가능하게 해준다.

[영문]Purpose of the study: Formalin is the most widely used fixative because of its low price and good capacity of preserving morphology of a fixed tissue. However the cross-linking effect of formalin can cause some damage on macromolecules (DNA, RNA, protein) of fixed tissues. The purpose of this study is to develop a new ideal and safe fixative that will have nearly the similar grade of morphological shape to that of formalin, which could be used without problems not only in many clinically required special chemical and immunohistochemical stainings, but also in molecular biological tests.

Methods: After developing environment friendly and nontoxic fixatives (WONFIX) through the comparative analysis of several fixatives in alcohol series, the fixation characteristics of developed fixatives have been compared with other fixatives by using rat or human tissues. By selecting the frozen tissue and 5 different fixatives (1.WONFIX 2.Carnoy’s fixative 3.methacarn 4.Wolman’s solution 5.formalin), the tissue was fixed for 24hours by using each fixative and then embedded in paraffin. By using an optical microscope, the morphological pattern in each fixative was evaluated to read the quality of morphological finding in A~E grades and the immunohistochemical staining was performed to compare the antigen expression patterns. After extracting DNA, RNA, and protein from the paraffin blocks of fixed tissue, the concentration of macromolecules and the statistical significance were compared by using the Wilcoxon signed rank test method. Regarding the housekeeping gene, PCR, real-time PCR, and Western blot analysis were performed.

Results: In the optical microscopic evaluation of fresh tissue and the tissues fixed at 5 different types of fixatives, the best tissue morphology was observed in the tissue fixed at formalin, which was followed by WONFIX. Although the immunohistochemical staining results by using 14 antibodies resulted to show the same positive and negative expression frequency, the staining intensity observed in the tissue fixed at WONFIX was the strongest and showed nearly the similar staining pattern to that of formalin. The largest amount of DNA extraction was made in the tissue fixed at WONFIX (p<0.05), which enabled to perform PCR upto 1.5kb. The extracted amount of RNA at the time of using WONFIX fixative was placed at the fourth grade, but the amount was significantly larger than the amount that was extracted from formalin (p<0.05). The mean threshold cycle number (CT) value acquired by performing the real-time PCR was found to be 11.3 in fresh tissue and 12.3 in WONFIX. The mean CT value was acquired by performing real-time PCR for the extracted RNA after the microdissection of 1000 cells, which resulted to show 19.4 in fresh tissue, 23.2 in WONFIX, and 30.6 in formalin. The RNA preservation state of the tissue fixed at WONFIX was better than the tissues fixed at other fixatives. When the protein quality was compared by conducting the Western blot analysis, the protein extracted from the tissue fixed at WONFIX resulted to show similar state that could be observed at the fresh tissue extraction.

Conclusions: WONFIX is the ethanol based fixative, which is environment friendly and safe without having heavy metals or toxic chemical substances. At the same time, the excellent morphological findings could be its characteristic, which enables to perform clinically required molecular biology tests.