Regulation of Rb function by FBI-1 through repression of Rb gene transcription

Abstract

[한글]FBI-1 (Factor that Binds to the Inducer of short transcripts of human immunodeficiency virus-1) 은 N-말단에 POZ-domain과 C-말단에 4개의 Kruppel-like zinc finger를 갖는 단백질으로 여러 유전자들의 promoter에 작용하여 전사작용인자로써 지방조직의 분화, 발암과정에 있어서 중요한 역할을 한다. 최근 연구에 의해 FBI-1은 발암과정에 관여되고 있으며, 여러 암세포에서 FBI-1의 발현이 증가되어있다고 보고되었다. 우리는 FBI-1이 종양 억제 유전자 중의 하나인 Retinoblastoma (Rb) 유전자의 전사에 어떠한 영향을 주는지 알아보았다. Rb 단백질은 세포 주기의 조절, 세포사멸, 세포 분화 그리고 종양 억제에 중요한 역할을 하는 단백질이다. 우리는 FBI-1의 결합가능 서열로 도출된 서열 GDGGGYYYY 서열을 이용하여 Rb promoter에 여러 FBI-1 결합 부위 (FRE) 가 존재하고, 이를 통하여 FBI-1이 Rb 유전자의 전사를 조절할 수 있을 것으로 추측하였다. EMSA를 통해 4군데의 결합 가능 부위 (bp -308 to -300, bp -298 to -290, bp -244 to -236, bp -188 to -180) 를 발견하였다. 우리는 FBI-1이 Rb promoter에 직접적으로 결합함으로써, Rb 유전자의 전사를 억제시킨다는 것을 확인하였다. Rb 유전자는 Sp1, E4TF1, Fli-1, p53, ATF, E2F, CREB1, CDF-1와 같은 전사인자들에 의해 발현이 조절된다. Rb 유전자의 FRE 서열과 Sp1 결합 서열이 GC가 많이 존재한다는 점에서 유사하다. 우리는 EMSA를 통해 FRE1, FRE3, FRE4와 GC-box 2 지역이 FBI-1과 Sp1이 모두 결합이 가능하고, FRE3과 GC-box 2 부위에서 FBI-1이 Sp1과 경쟁적으로 결합할 수 있음을 발견하였다. FBI-1과 Sp1과의 경쟁적인 결합이 Rb 유전자의 전사를 억제하는 중요한 기전이라 생각된다. 또한, POZ-도메인 부위는 단백질-단백질 상호작용 기능을 가지는데, FBI-1의 POZ 부위가 BCoR, NCoR, SMRT와 결합함을 확인하였고, 이것이 Rb 유전자의 전사를 억제시키는데 중요하게 작용한다고 여겨진다.

FBI-1은 Rb의 발현을 억제함으로써 Rb가 수행하고 있는 세포기능에 영향을 줄 것이라 생각되어, FBI-1이 과발현된 HeLA 세포를 제조하고, FACS로 세포주기를 조사한 결과, DNA 합성단계 (S phase) 의 HeLA 세포수가 증가됨을 발견하였다.

결론적으로 FBI-1은 Rb 유전자의 발현을 조절하고, 이에 따라 세포 주기 진행을 촉진함으로써 발암과정에 있어서 중요한 역할을 하는 단백질이라 생각한다.

[영문]FBI-1 (also called Pokemon) is a transcription factor with a POZ-domain at N-terminus and four Kruppel-like zinc fingers at C-terminus. FBI-1 regulates transcription of various genes and plays important roles in differentiation, oncogenesis and adipocyte differentiation. Recently, FBI-1 was shown to have a proto-oncogenic activity and its expression is elevated in many cancer tissues. We investigated whether FBI-1 affects tumor suppressor Retinoblastoma (Rb) gene expression at transcription level. Rb protein plays important roles in the regulation of cell cycle, apoptosis, and cell differentiation and the role is important in tumor suppressor. We found that the several potential FBI-1 binding sites (FRE consensus sequence, GDGGGYYYY) are present in the proximal promoter region of Rb gene. The transcription of the Rb gene is potently repressed by FBI-1. We found that FBI-1 binds to the four FRE (bp -308 to -300, bp -298 to -290, bp -244 to -236, and bp -188 to -180) by EMSA in vitro and in vivo, as evidenced by ChIP assays. The transcription of Rb gene is regulated by transcription factor such as Sp1, E4TF1, Fli-1, p53, ATF, E2F, CREB1 and CDF-1 by acting on the region from bp -64 to -41, which is essential in transcription. The Rb promoter contains two Sp1 sites at bp -64 to -59 and bp -17 to -12, both known to be critical transcription. We found that FBI-1 could bind to one of the Sp1 binding site located at bp -17 to -12. Sp1 can bind three FREs located at bp -308 to -300, bp -244 to -236, and bp -188 to -180. We demonstrate that FBI-1 can repress transcription of Rb gene by competitive binding with Sp1 to the Sp1 binding GC-box (bp -17 to -12) and to the FRE (bp -244 to -236). Although the competition by FBI-1 can be important in transcription repression by excluding transcription activator Sp1 from the key regulatory elements, FBI-1 can also repress transcription by having repression domain called POZ-domain that was shown to repress transcription by recruiting corepressor protein complex, as shown for other POK family proteins, PLZF and Bcl-6. We investigated whether the POZ-domain of FBI-1 can recruit the corepressors such as BCoR, NCoR, mSin3A, and SMRT by mammalian two-hybrid reporter assays, and GST pull-down assays. The BCoR interacted with the POZ-domain of FBI-1 most strongly, which is followed by SMRT, and NCoR. mSin3A did not show significant molecular interaction. Histone deacetylation caused by corepressors might be important in the transcription repression. In conclusion, FBI-1 might repress transcription of Rb gene by competitive binding with Sp1 to some key regulatory elements and also by recruiting corepressors to the promoter region and chromatin modification.

Since Rb protein plays an important role in cell cycle arrest and Rb gene is repressed by ectopic FBI-1, FBI-1 may influence cell cycle, apoptosis, and cell differentiation by repressing Rb gene expression.