신경세포 내 칼슘채널의 전압비의존적 조절 메커니즘

Abstract

[한글]전압의존적 칼슘채널은 세포 내 칼슘의 농도를 조절하는 데에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 따라서 세포 내 칼슘의 조절과 이와 관련된 세포기능의 항상성을 이해하기 위해서는 전압의존적 칼슘채널이 조절되는 메커니즘을 세포 및 분자수준에서 규명하는 것이 반드시 필요하다 하겠다. 일반적으로 시냅스전달이 지나치게 항진이 될 경우 방출된 신경전달물질이 시냅스 말단에 존재하는 칼슘채널을 억제함으로써 신경기능을 정상으로 회복시켜주는 일종의 음성되먹임 메커니즘이 작동된다. 이러한 신경전달물질에 의한 칼슘채널의 억제는 전압의존적 억제와 전압비의존적 억제로 나누어진다. 전압의존적 억제의 메커니즘은 N-형 칼슘채널을 대상으로 분자수준에서 많이 규명되었지만 현재까지 칼슘채널의 전압비의존적 억제의 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 신경 칼슘채널의 전압비의존적 억제 메커니즘의 일부를 분자수준에서 규명하였다. 이를 위해 무스카린성 수용체인 인간 M1 수용체와 꼬마선충 GAR-3 수용체를 부교감 내심신경 및 COS-7 세포에 각각 이종발현을 시키고 전세포 패치클램프 방법을 사용하여 칼슘전류를 기록하였다.연구의 결과로 내심신경세포에 이종발현을 시킨 M1 무스카린성 수용체는 고전압에서 활성화되는 칼슘채널에 기능적으로 연결되어 카바콜(carbachol)의 농도에 의존적인 억제를 일으켰다. 역전사 연쇄중합반응의 분석결과 내심신경세포는 Gq/11 아과의 아형들을 모두 발현함을 확인할 수 있었다. M1 수용체 활성에 의한 칼슘채널의 억제는 전압비의존적으로 일어났으며, 광견병 독소에 민감한 Gq/11 단백질에 의해 매개되었다. 유리 Gbg를 트랜스듀신과 GRK2-ct로 완충하였을 때 칼슘채널의 억제 정도는 현저히 감소하였다. 반면에 유리 Gaq/11 RGS2나 PLCb-ct로 완충하였을 때 칼슘채널의 억제 정도는 영향을 받지 않았으나, 억제모드가 전압비의존적 모드에서 전압의존적 모드로 전환되었다. 세포 내 칼슘을 BAPTA로 완충하였을 때는 전압비의존적 억제가 일어나는 속도가 감소하였다.한편, COS-7 세포에 이종발현을 시킨 GAR-3 수용체는 a1B/b3/ a2d로 이루어진 N-형 칼슘채널에 기능적으로 연결되어 아트로핀에 민감한 억제를 일으켰다. GAR-3 수용체 활성에 의한 칼슘채널의 억제는 옥소트레모린(oxo-M)의 농도의존적 및 전압비의존적으로 일어났으며, 억제작용의 역가는 M1 수용체를 발현하였을 때와 거의 차이가 없었다. GDPβS를 세포 내로 넣어주었을 때, oxo-M에 의한 칼슘채널의 억제가 차단되었다. GAR-3 수용체 활성에 의한 칼슘채널의 억제는 콜레라 독소와 백일해 독소의 전 처치에 의해서는 차단되지 않았지만 광견병 독소의 전 처치에 의해서는 차단되었다. 유리 Gbg를 트랜스듀신과 GRK2-ct로 완충하였을 때 칼슘채널의 억제 정도는 현저히 감소하였다. 뿐만 아니라 유리 Gaq/11을 PLCb-ct로 완충하였을 때에도 칼슘채널의 억제정도가 50% 정도 감소되었다. 한편, 억제모드가 전압비의존적 모드에서 전압의존적 모드로 전환되는 것을 kinetic slowing으로 확인하였지만 prepulse facilitation은 뚜렷하게 나타나지 않았다. 또한 GAR-3 수용체 활성에 의한 칼슘채널의 억제 모드는 칼슘채널 b 보조 서브유닛에 의존적으로 나타났다.이상의 결과로부터 칼슘채널의 전압비의존적 억제에는 Gq/11 단백질의 a 및 bg 서브유닛이 모두 필요한데 Gbg가 칼슘채널의 억제에 주된 역할을 하며, Gaq/11은 전압비의존적 모드를 유지하는 데 중요한 역할을 함을 알 수 있었다. 세포 내 칼슘은 Gaq/11이 작용하는 속도를 빠르게 해주는 보조인자의 역할을 할 것으로 추측되며, 칼슘채널을 이루고 있는 보조서브유닛, 특히 Cavb의 역할이 중요함을 알 수 있었다.

[영문]Voltage-dependent calcium channels (VDCCs) play pivotal roles in regulation of intracellular calcium ([Ca2+]i). For understanding homeostasis in cellular functions related to regulation of [Ca2+]i, the mechanisms underlying regulation of VDCCs should be defined at a molecular level. In general, the VDCCs at presynpatic terminals are inhibited by transmitter as a negative feedback mechanism for restoration of normal functions when synaptic transmission is overly stimulated. There are two types of Ca2+ channel inhibition: voltage-dependent (VD) and voltage-independent (VI). Although the mechanisms underlying VD inhibition of Ca2+ channels have been well defined, those for the VI inhibition remain unclear. In the present study, thus, molecular mechanisms underlying the VI inhibition of neural Ca2+ channels in part was examined. In this regard, Ca2+ currents (ICa) were recorded using the whole-cell patch-clamp technique in parasympathetic intracardiac neurons (ICNs) and COS-7 cells heterologously expressing human M1 and C. elegans GAR-3 muscarinic receptors (GAR-3R), respectively.As results, the M1 receptors (M1R) expressed in the ICNs was functionally coupled to VDCCs to produce carbachol concentration-dependent ICa inhibition. RT-PCR analysis revealed that the ICNs express all members of the Gq/11 family. The ICa inhibition by activation of M1R was VI and mediated by PMT-sensitive Gq/11 proteins. When Gbg was chelated by transducin and GRK2-ct co-expressed in the ICNs, the Ica inhibition was significantly reduced. In contrast, chelation of Gaq/11 with RGS2 or PLCb-ct did affect not the magnitude of the ICa inhibition, but the inhibition mode by converting VI into VD. When BAPTA chelated [Ca2+]i, the speed of the VI inhibition became slower. When heterologously expressed in COS-7 cells, the GAR-3R was coupled to N-type Ca2+ channels composed of a1B/b3/a2d subunits to produce atropine- sensitive ICa inhibition. The ICa inhibition by activation of GAR-3R was oxoM concentration-dependent and VI. The IC50 values for GAR-3R and M1R-mediated ICa inhibitions were similar in COS-7 cells. GAR-3R-mediated ICa inhibition was blocked by dialysis of GDPbS and by pre-treatment of PMT, but not CTX and PTX. When Gbg was chelated by transducin and GRK3-ct co-expressed in COS-7 cells, the ICa inhibition was significantly reduced. Chelation of Gaq/11 with RGS2 or PLCb-ct also reduced 50 % of the ICa inhibition. Conversion of the inhibition mode from VI into VD was confirmed by kinetic slowing in the presence of oxoM although the prepulse facilitation was not observed. In addition, the mode of GAR-3R- mediated ICa inhibition was dependent on Cavb subunits.Taken together, the VI inhibition of VDCCs requires both Gaq/11 and Gbg which are critical for the mode and magnitude of ICa inhibition, respectively. On the other hand, [Ca2+]i, appear to act as a supplemental factor to accelerate the action of Gbg on the VDCCs, and the auxiliary subunits of the VDCCs, especially Cavb may play an important role in regulation of the VDCCs.