고포도당으로 자극한 복막 중피세포에서 collagenase와 TIMP의 변화

Abstract

[한글]

지속성 외래 복막투석은 말기 신부전증 환자의 치료 방법으로 널리 이용되고 있으나, 장기간 시행하면 복막 섬유화로 인한 복막의 투과성 증가 및 한외여과부전으로 인하여 복막투석을 더 이상 시행하지 못하는 상태까지 이르게 되는 것이 큰 제한점이라고 할 수 있다. 복막 섬유화는 병리학적으로 중피세포의 탈락과 세포 외 기질의 축적이 특징적인 소견이다. 세포 외 기질의 축적은 기질의 합성과 분해의 불균형에 의하여 나타나는 현상으로, 당뇨병성 신병증을 대상으로 이에 대한 많은 연구가 있어 왔다. 또한, 복막 중피세포에서도 고포도당 조건 하에서 세포 외 기질의 합성 증가를 확인한 연구들은 종종 있지만, 복막 섬유화의 기전을 합성이 아닌 분해의 측면에서 규명한 연구는 극히 미미한 실정이다.이에 본 연구자는 복막 중피세포에서 고포도당이 세포 외 기질의 분해에 미치는 영향을 알아보기 위하여 복막 섬유화에서 주로 축적되는 세포 외 기질인 제 1형 및 제 3형 collagen을 분해하는 것으로 알려져 있는 collagenanses (MMP-1, MMP-8, 그리고 MMP-13)와 tissue inhibitor of matrix metalloproteinases (TIMPs; TIMP-1과 TIMP-2)의 발현과 활성도를 측정하였다. 사람의 복막으로부터 분리한 복막 중피세포를 이용하여 정상 포도당 (5.6 mM 포도당), 정상 포도당+만니톨 (34.4 mM 만니톨), 그리고 고포도당 (40 mM 포도당) 배양액으로 72시간 동안 배양한 후 세포와 배양액을 수집하였다. Collagenases와 TIMPs의 mRNA 발현은 real time-PCR, 단백 발현은 Western blot, 그리고 collagenases의 활성도는 ELISA로 측정하여, 다음과 같은 결과를 얻었다.1. 제 1형 collagen의 단백 발현은 정상 포도당군에 비하여 고포도당군에서 1.4배 증가되었던 반면 (P<0.05), 고포도당에 의한 제 3형 collagen의 단백 발현에는 의미있는 변화가 없었다.2. MMP-1과 MMP-8의 mRNA 발현은 고포도당군에서 정상 포도당군에 비하여 각각 2.10배, 2.03배 감소하였다(P<0.05). 그러나 양군 사이에 MMP-13의 mRNA 발현에는 유의한 차이가 없었다.3. 세포 배양액 내 collagenases (MMP-1, MMP-8, 그리고 MMP-13)의 단백 발현은 세포 배양액에서는 고포도당군에서 정상 포도당군에 비하여 의미있게 감소되었다 (고포도당군 vs. 정상 포도당군: MMP-1, 32.6%; MMP-8, 21.3%; MMP-13, 23.8%)(P<0.05). 그러나 양군 사이에 세포 용해액 내 collagenase의 단백 발현에는 유의한 차이가 없었다.4. 복막 중피세포 배양액 내 MMP-1및 MMP-8의 그리고 MMP-13의 활성도는 고포도당군에서 각각 12.6±0.3 pg/ml, 14.9±0.93 pg/ml로 정상 포도당군의 36.0±4.7 pg/ml, 31.3±7.03 pg/ml에 비하여 의미있게 감소되어 있었다(P<0.05). 그러나 양군 사이에 MMP-13의 활성도는 각각 37.5±0.43 pg/ml, 35.6±0.52 pg/ml로 유의한 차이가 없었다.5. TIMP-1과 TIMP-2의 mRNA 발현은 정상 포도당군에 비하여 고포도당군에서 각각 1.8배, 1.5배 증가되었다 (P<0.05).6. 세포 배양액 내 TIMP-1과 TIMP-2의 단백 발현은 고포도당군에서 정상 포도당군에 비하여 각각 1.7배, 1.6배 증가되었다 (P<0.05). 그러나 양군 사이에 세포 용해액 내 TIMP-1과 TIMP-2의 단백 발현에는 의미있는 차이는 없었다.이상의 실험 결과로 미루어, 복막 중피세포에서 고포도당에 의한 collagenases의 발현 감소와 TIMPs의 발현 증가로 인한 세포 외 기질의 분해 감소도 복막 섬유화의 병태생리에 일부 관여할 것으로 생각된다.

[영문]Continuous ambulatory peritoneal dialysis (CAPD) has been used as a long-term renal replacement therapy for patients with end-stage renal disease. However, after long-term treatment with CAPD, peritoneal fibrosis (PF) has been observed in some patients, resulting in membrane failure. In vitro and in vivo studies have demonstrated that denudation of mesothelial cells from the peritoneum and excessive deposition of extracellular matrix (ECM) are the structural determinants of PF. ECM accumulation results from imbalanced matrix protein metabolism between synthesis and degradation, which has been widely investigated in diabetic nephropathy. Previous studies have demonstrated that ECM synthesis is increased in human peritoneal mesothelial cells (HPMCs) under high glucose conditions, but the effects of high glucose on degradative pathways, which is mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), have not fully explored.The purpose of this study was to elucidate the effects of high glucose on these proteolytic processes in cultured HMPCs. Since the main ECMs accumulated in PF are type I and type III collagen, I investigated collagenases (MMP-1, MMP-8, and MMP-13) activity, expression and TIMPs (TIMP-1 and TIMP-2) expression, which are known to be involved in the degradation of type I and type III collagen. In addition, I determined type I and type III collagen levels in high glucose-stimulated HPMCs. HPMCs were isolated from a piece of human omentum and were incubated with M199 media containing 5.6 mM glucose (LG), 5.6 mM glucose + 34.4 mM mannitol (LG+M), or 40 mM glucose (HG). After 72 hours, cells were harvested for messenger RNA and protein, and media were collected. mRNA expressions was determined by real time-PCR, protein expressions by Western blot, and collagenase activities by ELISA. The results were as follows;1. Type I collagen protein expression was significantly higher in HPMC exposed to HG compared to LG cells (average 1.4-fold, p<0.05), whereas there was no difference in type III collagen protein expression.2. MMP-1 and MMP-8 mRNA expression in HG-stimulated HPMCs were decreased by 55% and 51%, respectively, compared to LG cells (P<0.05). However, there was no difference in MMP-13 mRNA expression between LG and HG cells.3. Collagenase protein expressions were significantly lower in HG media compared to LG media (MMP-1, 32.6%; MMP-8, 21.3%; MMP-13, 23.8% of LG) (p<0.05), but there were no differences in collagenases protein expression in cell lysates.4. MMP-1 and MMP-8 activities in HG media (12.6 ？ 0.3 pg/ml, 14.9 ？ 0.93 pg/ml, respectively) were significantly lower than those in LG media (36.0 ？ 4.7 pg/ml, 31.3 ？ 7.0 pg/ml, respectively) (p<0.05). but there was no difference in MMP-13 acitivity between LG and HG media.5. TIMP-1 and TIMP-2 mRNA expression in HG stimulated HPMCs were 1.8-fold and 1.5-fold higher, respectively, compared to LG cells (P<0.05).6. TIMP-1 and TIMP-2 protein expression in HG media were 1.7-fold and 1.6-fold higher, respectively, compared to LG media (p<0.05), but there were no differences in TIMP protein expression in cell lysates.In conclusion, these results suggest that the impairment of matrix degradation may contribute to ECM accumulation in peritoneal fibrosis.