Analysis of rdxA and frxA involved in metronidazole resistance of Helicobacter pylori

Abstract

[한글]

Helicobacter pylori의 메트로니다졸 항생제에 대한 내성은 oxygen-insensitive NADPH nitroreductase를 암호화하는 rdxA 그리고, NAD(P)H-flavin oxidoreductase를 암호화하는 frxA 유전자들과 관련되어 있다고 알려져왔다. 그러나, rdxA 또는 frxA 유전자가 메트로니다졸 내성에 관련이 있는지를 확인 할 수 있는 연구방법의 한계 때문에, rdxA 또는 frxA 유전자 돌연변이와 H. pylori의 메트로니다졸 내성과의 관련성은 여전히 논쟁의 여지가 있다.본 연구에서는 메트로니다졸 내성과 관련된 유전자 돌연변이와 H. pylori의 자연적인 유전자 다양성과의 차이점을 구별하고 분석하기 위해, 메트로니다졸에 민감한 G27 H. pylori의 rdxA 유전자를 H. pylori 임상분리균의 rdxA 유전자로 대체하는 새로운 방법을 이용해서 rdxA 또는 frxA 유전자들이 메트로니다졸 내성에 관여하는지 평가하였다.G27 H. pylori의 rdxA 유전자를 메트로니다졸 내성 임상분리균의 넌센스 돌연변이가 일어난 rdxA 유전자로 대체한 변형균은 메트로니다졸 내성을 얻었다. 그러나, 메트로니다졸 내성 임상분리균의 미스센스 돌연변이로 몇 개의 아미노산이 치환되어 있는 rdxA 유전자로 대체한, 변형균은 메트로니다졸 내성을 얻지 못했다. 이 결과를 볼 때, G27 변형균의 메트로니다졸 내성을 유도한 임상분리균의 넌센스 RdxA는 기능을 하지 않음을 알 수 있고, 메트로니다졸 내성을 유도하지 않은 미스센스 RdxA는 메트로니다졸 내성에 중요한 아미노산 치환을 가지고 있지 않아 기능에 영향이 없는 것을 의미한다.그리고, 메트로니다졸에 민감한 H. pylori에서 전체 rdxA 유전자 서열을 가지고 있지만, frxA 유전자는 넌센스 돌연변이로 인하여 FrxA 아미노산 서열 중간이 종결된 것을 확인 할 수 있었다. 이는 frxA 유전자 불활성만으로는 메트로니다졸 내성을 나타내기에 충분하지 않다는 것을 의미한다. 하지만, frxA 불활성이 rdxA의 불활성과 같이 일어났을 경우에는 메트로니다졸 내성을 높여주었다 (MIC, 64 to ≥ 256 ㎍/㎖). G27 H. pylori의 rdxA 유전자를 5종류 메트로니다졸 내성을 나타내는 H. pylori 임상분리균의 rdxA 유전자로 대체한 결과, 이 중 2종류 H. pylori의 rdxA 와 frxA 유전자들은 메트로니다졸 내성에 관련이 없는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, H. pylori의 메트로니다졸 내성은 rdxA 와 frxA 유전자의 돌연변이 없이도 일어날 수 있기에 다른 유전자들이 메트로니다졸 내성에 관여함을 암시한다.

[영문]Metronidazole (MTZ) resistance in Helicobacter pylori has been found to be associated with mutations in rdxA, a gene encoding an oxygen-insensitive NADPH nitroreductase, and mutations in frxA, a gene encoding a NAD(P)H-flavin oxidoreductase. However, MTZ-resistant H. pylori associating with mutation of rdxA or frxA is still controversial. One of limitations in the controversial topic was the lack of the system to confirm the contribution of rdxA or frxA mutations in MTZ resistance. In this study, a novel approach of the rdxA replacement was performed to distinguish resistance-associated nucleotide mutation from natural genetic diversity of H. pylori and hence to evaluate the contribution of rdxA or frxA mutations in MTZ resistance.The rdxA of MTZ-sensitive wild-type G27 H. pylori was replaced with rdxA of clinically isolated H. pylori. The replacement with the inactivated rdxA resulted in MTZ-resistant H. pylori while the replacement with the missense-mutated rdxA containing several amino acid substitutions failed to transfer MTZ-resistant phenotype. It suggested that nonfunctional truncated RdxAs in 2 MTZ-resistant H. pylori isolates can induce MTZ resistance but none of RdxA with amino acid substitutions in 3 MTZ-resistant isolates was unable to cause the MTZ resistance. It is of importance that a nonsense-mutated frxA was found in the MTZ-sensitive H. pylori, indicating that the deletion of frxA alone is not sufficient for MTZ resistance. However, the deletion of frxA seemed to enhance MTZ resistance (MIC, 64 to ≥256 μg/ml) in the presence of nonfunctional truncated RdxA. In 2 isolates among 5 MTZ-resistant H. pylori, rdxA and frxA are likely functional and not responsible for the MTZ-resistant phenotype. Therefore, the MTZ resistance in H. pylori may arise without mutations in rdxA and frxA, clearly suggesting that other genes may be involved in MTZ resistance.