Recombinant adeno-associated virus-mediated gene transfer in homocystinuria mice

Abstract

[한글]

Homocystinuria는 선천성 대사질환의 하나로 상염색체 열성으로 유전되는 유전질환으로써 CBS (Cysthathionine b-synthase) 유전자가 그 원인유전자로 알려져 있다. 유전자의 결핍으로 urine내의 homocysteine의 농도가 크게 증가하여 지능저하, 골격계의 이상, 혈관의 혈전증의 임상증상을 초래하는 것으로 보고되고 있다.

Homocystinuria 질병의 치료방법은 약물치료를 기본으로 하고 있으나 아직까지 효과적인 치료방법이 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 질병을 보다 안전하고 효과적으로 치료하기 위한 방법으로 유전자치료가 가능한지를 알아보고자 하였다. 최근 유전자치료에 효과적이라고 알려져 있는 virus vector system을 이용하여 CBS유전자의 재조합바이러스를 만들어 in vitro system에서 유전자의 발현과 활성도를 측정하여 환자의 유전자치료에 이용할 수 있는지를 알아보고자 하였다. Viral vector system 중에서 homocystinuria와 같은 상염색체열성의 유전질환에 효과적으로 이용할 수 있다고 알려진 adeno-associated viral vector를 이용하여 본 연구를 수행하였다.

Adeno-associated virus type 2를 기본바이러스로 하여 transgene (CBS cDNA)을 삽입하여 construct를 제작하였다. CBS유전자는 효소의 활성을 억제하는 기능을 가지고 있는 regulatory domain을 가지고 있다고 알려져 있어 CBS유전자의 regulatory domain을 돌연변이 시킨 것과 제거시킨 것도 cloning하여 정상 CBS 유전자와 그 효율을 비교하였다. In vitro system에서 해당 유전자가 세포내로 효율적으로 전달되고 있음을 확인하였고 construct간의 효소활성을 비교한 결과 정상의 유전자에서 효율이 가장 효과적이었다.

Homocystinuria의 동물질환모델을 이용하여 치료효과를 알아본 결과 치료군에서 질환모델의 수명의 연장과 plasma 내의 homocysteine의 농도저하 그리고 간의 cytoplasm내의 microvesicular lipid droplets이 감소되고 전달된 유전자가 발현되고 있음을 확인하였다. 그러나 치료효과가 장기간 지속되지 못하는 단점을 나타내었다. 이러한 단점을 극복하기 위해서는 유용한 동물질환모델의 개발과 질병의 원인 등에 대한 다양한 연구가 먼저 선행되어야 할 것이다.

이상의 본 연구의 결과를 통해 AAV를 매개로한 유전자치료가 homocystinuria 질병치료에 효과적인 치료방법의 하나로써 그 가능성을 제시하고 있으며 앞으로 인간의 질환 환자의 치료에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

[영문]Homocystinuria is a metabolic disorder caused by a deficiency of cystathionine β-synthase (CBS). Patients with homocystinuria show clinical symptoms such as mental retardation, lens dislocation, vascular disease with life-threatening thromboembolisms and skeletal deformities. Generally, the major treatments for CBS deficiency include pharmacologic doses of pyridoxine or dietary restriction. However, there is no effective treatment for this disease up to now and gene therapy can be an attractive novel approach to treatment of the disease. We investigated whether a recombinant adeno-associated virus could be used as a CBS gene transfer vector to reduce the excessive homocysteine level in the homocystinuria mouse model. Recombinant adeno-associated virus vector encoding the human CBS gene (rAAV-hCBS), driven by EF1-a promoter, was infused into CBS-deficient mice (CBS-/-) via intramuscular (IM) and intraperitoneal (IP) injection. IP injection was more efficient than IM injection for prolongation of lives and reduction of plasma homocysteine levels. After 2 weeks of gene transfer by IP injection, serum homocysteine level was significantly decreased in treated mice compared with the age-matched controls and the life span was extended about 1.5 times. Also, increased expression of CBS gene was observed by immunohistochemical staining in livers of treated CBS-/- mice and microvesicular lipid droplets was decreased in cytoplasm of liver. These results demonstrate the possibility and efficacy of gene therapy by AAV-mediated gene transfer in homocystinuria patients.