인체 위암 세포주에 retroviral vector를 이용한 p53 종양 억제 유전자 형질도입의 효과

Abstract

[한글]

위암은 우리 나라에서 가장 흔한 악성 종양으로 위암의 치료 성적을 향상시키기 위해 다각적으로 노력하고 있으나 그 치료 성적은 아직까지 만족할 만하지 못하다. 위암의 치료효과를 개선하기 위해서는 기존의 치료 방법인 수술, 항암요법 또는 방사선 치료 이외에 새로운 치료 방법의 개발이 절실한데, 유전자 치료는 위암의 새로운 치료 대안으로 기대되고 있어 연구할 필요가 있다고 본다. 이에 본 연구에서는 인체 위암 세포주에 p53 종양 억제 유전자를 형질도입하여 p53 종양 억제 유전자를 이용한 위암 유전자 치료의 효용성 여부를 규명하고자 븐 연구를 시행하였다.

10개의 실험 대상 위암 세포주를 배양한 다음 DNA를 추출하여 PCR-SSCP(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism) 분석과 염기 서열 분석을 시행하고, 인체 p53 cDNA를 포함하는 retroviral vector LNC/p53와 master retroviral packagin

g cell line PA 317/LN0/p53를 제조한 후 재조합 retrovirus의 역가를 측정하였다. p53 유전자의 형질도입이 인체 위암 세포주 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 p53 유전자에 돌연변이가 확인된 N-87 세포주와 정상형 p53 유전자를 가진 YCC-S-2 세포주를 이용하여 in vitro와 in vivo에서 LNC/p53 retrovirus로 감염시켜 감염 전후의 성장 속도를 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1) PCR-SSCP 분석 결과 대상 위암 세포주 10개 중 6개에서 p53 유전자의 돌연변이를 착인할 수 있었고 이는 다시 염기 서열 분석으로 확인하였다.

2) 돌연변이형 p53 유전자를 함유하고 있는 N-87 세포주에서 p53 유전자를 형질도입했을 때에는 p53 유전자를 형질도입하지 않았을 때에 비해 유의한 세포 성장의 억제를 관찰할 수 있었으며, 이는 retrovirus의 용량에 의존적으로 비례하였다.

3) 정상형 p53 유전자를 가지고 있는 YCC-S-2 세포주에서는 p53 유전자를 형질도입한 군에서 p53 유전자를 형질도입하지 않은 대조군에 비해 세포 성장 억제효과를 관찰할 수 없었다.

4)누드생쥐에서 N-87 세포주에 의해 형성된 종괴는 LNC/p53 retrovirus를 주사하였을 때에는 LNCX retrovirus를 주사하였을 때에 비해 종괴 성장이 억제되었다. 양 군 모두에서 광학현미경 검사 상 예정사(apoptosis)를 관찰할 수 있었는데, p53 유전자를 형질도입

하였을 때에 더 많은 경향의 예정사를 관찰할 수 있었으며, 전자현미경 검사로 p53 유전자를 형질도입한 경우에 예정사의 특징적인 소견을 관찰할 수 있었다.

5) 누드생쥐에서 YCC-S-2 세포주에 의해 형성된 종괴에서는 실험군락 대조군 모두에서 지속적인 종괴의 성장을 보였으며 성장 속도의 차이는 없었다.

6) p53 유전자의 소실로 p53 단백질을 만들지 못하는 KATO-Ⅲ 세포주를 이용하여 LNC/p53 retrovirus 감염 후 면역조직화학 염색법으로 관찰한 p53 단백질의 표현율은 투여된 LNC/p53 retrovirus에 용량 의존적이었으나, 100 m.o.i.(multiplicity of infection)/cell의 역가로 감염시켰을 때에도 그 표현율은 5% 미만이었다.

이와 같은 결과를 종합하여 다음과 같은 결론을 얻었다. p53 유전자를 함유하는 retrovirus 투여에 의한 위암 세포주의 성장 억제 효과는 p53 유전자의 돌연변이를 함유하고 있는 위암 세포주에서 뚜렷하였으며, 실험 동물에서 p53 유전자를 함유하는 retrovirus 투

여에 의한 위암 종괴의 성장은 p53 유전자의 돌연변이가 함유된 위암 세포주에서 약간 억제되었다. 종양 억제 효과가 누드생쥐에서 현저하지 않았던 것은 p53 유전자를 함유하는 retrovirus의 낮은 감염 효율이 원인이었던 것으로 생각된다.

[영문]

Gastric cancer is one of the most prevalent cancers in Korea, which has been studied in many different ways to improve the therapeutic outcome, but it is not yet satisfactory. It is clearly important to develop new therapeutic modalities such as gene therapy for improving the therapuetic outcome of gastric cancer besides the conventional modalities such as operation, chemotherapy or radiation therapy. This study was conducted to evaluate the effectiveness of retroviral-mediated p53 tumor suppressor gene therapy in gastric cancer.

Ten human gastric cell lines were cultured and their DNAs were analysed with PCR-SSCP(polymerase chain reaction - single strand conformation polymorphism) and DNA sequencing. After construction of retroviral vector LNC/p53 containing human p53 cDNA and master packaging cell line PA 317/LNC/p53, the titer of recombinant retrovirus was measured. To investigate the effect of retroviral-mediated p53 gene transduction in human gastric cancer cell lines, the growth rates of broth N-87 cell line with mutant p53 and YCC-S-2 cell line with normal p53 were compared before and after infection with LNC/p53 retrovirus in vitro and in vivo.

The following results were obtained.

1) In PCR-SSCP, 6 out of 10 human gastric cancer cell lines had the mutant p53 gene, which was reconfirmed by nucleotide sequencing.

2) The growth inhibition of N-87 cells after p53 transduction using retroviral vector was significant when compared to the parent N-87 cells, which was dependent on the retroviral titer.

3) The growth of both p53 transduced YCC-S-2 cells and the parent YCC-S-2 cells were not different.

4) In nude mice, growth of the tumors formed by N-87 cells were slightly inhibited after retroviral-mediated p53 gene transduction. Apoptotic changes were more prominent in tumors which were infected with p53 containing retrovirus as compared to those of p53 non-containing retrovirus under light and electron microscopes.

5) The growth of tumors formed by YCC-S-2 cells were not inhibited by p53 transduction in nude mice.

6) The expression rate of p53 protein after p53 containing retroviral infection in KATO-Ⅲ cell line, which showed the deletion of p53 gene, was dependent on LNC/p53 retroviral titer. However, the expression rate was less than 5% with the titer of 100 m.o.i.(multiplicity of infection)/cell upon immunohistochemical analysis.

In conclusion, the growth inhibition by retroviral-mediated p53 transduction in human gastric cancer cell lines was significant in gastric cancer cell line with mutant p53 in vitro, and the growth of turners formed by gastric cancer cell line with mutant p53 was slightly inhibited after p53 transduction using retroviral vector in nude mice. Only slight inhibition of tumor growth in nude mouse was thought to be due to low transduction efficiency.