한국인 선천성 부신과형성 환자에서 21-Hydroxylase의 유전자분석

Abstract

[한글]

선천성 부신과형성은 상염색체 열성으로 유전되는 질환으로 부신 내에서 스테로이드의 생합성에 필요한 효소의 결핍으로 발생한다. 대부분 21-hydroxylase의 결핍이 원인이 되며, 그 빈도는 14,000명 출생당 1명꼴로 보고되고 있다. 21-hydroxylase 결핍에 의한 선천성 부신과형성에서는 효소의 결핍으로 코르티솔과 알도스테론이 감소하고 부신 남성호르몬이 증가하게 되며, 이에 따른 임상증상이 나타난다. 치료는 부족한 코르티코스테로이드 호르몬을 보충하는 것이며, 외부성기의 남성화가 초래된 여자 환자에서는 외부성기의 성형수술이 필요하다. 최근에는 임신중에 조기 진단과 치료를 시작하여 여자 환자에서 보이는 외부성기의 남성화를 예방하려는 연구가 이루어지고 있으며, 따라서 21-hydroxylase 결핍증의 분자유전학적인 진단의 중요성이 더욱 강조되고 있다. 21-hydroxylase 결핍증을 일으키는 유전자의 돌연변이로서는 CYP21 유전자의결실 외에도, CYP21 유전자내의 염기 변화가 보고되고 있다. 그러나 이러한 보고들은 외국의 연구결과이므로 한국인에게 그대로 적용하기는 힘들다는 문제점이 있다. 따라서 본 연구는 한국인에서 21-hydroxylase

결핍에 의한 선천성 부신과형성을 일으키는 돌연변이의 분포를 알아보고자 하였으며, 돌연변이의 형태에 따른 임상증상의 양상을 조사하여 유전자형(genotype)과 표현형(phenotype)의 관계를 밝히고자 하였고, 나아가 이 질환의 효자적인 분자유전학적인 진단방법을 모색하고자 하였다.

선천성 부신과형성의 임상 양상과 생화학적 검사상 21-hydrokylase 결핍증으로 확진받은 환자 28명을 대상으로 말초혈액에서 ONA를 분리하였다. 분리한 genomic DNA를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 증폭시켰다. 이때 진성 유전자(activegene)인 CYP21 유전자만 선택적으로 증폭시키기 위해 가성 유전자(pseudogene)에서는econ 3 부위에 8개의 base pair가 결실되어 있는 점을 이용하여, 이 8개의 base Pair를 포함하는 primer를 사용하였다. 염기서열 결정(sequencing)은 직접 염기서열 결정(direct sequencing)을 하였으며 dideoxy chain-termination 방법으로 시행하였다. 염기서열 결정의 부위는 21-hydroxylase 결핍증을 일으키는 돌연변이가 가장 흔한 부위로 알려진 염기 위치부터 시행하였으며, 이 부위에서 돌연변이가 없는 경우는 나머지 exon의 염기서열을 결정하였다. 또한 CYP21 유전자의 결실 확인은 가성 유전자에는 exon 3 부위에 8개의 base pair 결실이 존재하므로 이 부위보다 바깥쪽에서 시작되는 primer를 사용하여 진성 유전자와 가성 유전자를 모두 증폭시킨 후, TaqⅠ 제한효소로 반응시켜 분절로 나누어지는지를 조사하므로써 결실 유무를 확인하였다. 유전자형에 따른 임상양상의 차이는 질환을 일으키는 돌연변이를 in vitro ex-pression 연구 결과 밝혀진 효소의 활성정도에 따라 4군으로 나누어 임상양상을 비교하였다.

연구 결과 CYP21 유전자의 결실을 포함하여 7가지 형태의 돌연변이가 발견되었으며, 이중 Arg103Lys 돌연변이는 21-hydroxylase 효소 기능에는 영향을 주지 않는 것으로 알려진 돌연변이였으며, His245Tyr 돌연변이는 아직 보고된 적이 없는 돌연변이로서 본 연구에

서 처음으로 확인된 것이었다. 각 돌연변이의 CYP21 유전자내에서의 mutated allele의 빈도는 CYP21 결실이 10.7%(6/56), Ⅰ2 splice 돌연변이가 23.2%(13/57), Ⅰ1e173Asn 돌연변이가 14.3%(8/56), His245Tyr 돌연변이가 1.8%(1/56), Gln319s1op 돌연변이가 3.6%(2/5

6), Arg357Trp 돌연변이가 3.6%(2/56), Arg103Lys 돌연변이가 26.8%(15/56)로서, silent mutation인 Arg103Lys 돌연변이를 제외하면 모두 57.2%에서 질환의 원인이 되는 돌연변이가 발견되었다.28명의 환자중 14명의 환자에서 21-hydroxylase 결핍증의 원인이 되는 돌

연변이가 모두 발견되었으며, 각 환자에서 보이는 돌연변이들의 조합은 9종류였다. 돌연변이 형태에 따른 임상중상의 양상은 in vitro에서 효소의 활성도가 전혀 없는 null군에서는 1명중 모두(100%)에서 심한 염분소실 증상을 보였으며, 효소 활성도가 있기는 하지만 거의 나타나지 않는다고 보고된 A군에서는 7명중 5명(71%)에서 심한 염분소실 증상을 보였으며, 이중 염분소실 증상을 보이지 않았던2명은 모두 12 splice 돌연변이의 동형접합체(homozygote)인 경우였다. 비교적 덜 심한 효소활성도의 장애를 보인다고 보고된 B군에서는 6명중 모두(100%)에서 염분소실 증상없이 외부성기의 남성화만을 보여, 돌연변이 형태는 임상증상의 심한 정도와 잘 일치하였다.

본 연구의 결과 한국인 선천성 부신과형성 환자에서 21-hydroxylase 결핍을 일으키는 돌연변이의 유형을 알 수 있었으며, 유전자형의 확인이 임상양상의 심한 정도를 예측하는데 이용될 수 있으며, 대상 환자의 가족에서는 임신시 산전 진단이 가능해 졌다. 본 연구 결과를 기초로 하여 추후 보다 빠른 진단방법의 개발과 보인자의 검색에 대한 연구 및 실제 산전 진단에의 적용이 필요하리라 생각된다.

[영문]

Congenital adrenal hyperplasia(CAH) is a genetic disorder caused by an enzymeb deficiency in steroidogenesis. It is inherited as an autosomal recessive trait. A deficiency in 21-hydroxylase is the most frequent cause of the disease. The prevalence of the disease is 1 in 14,000 newborns in average. The symptoms vary

from severe neonatal disease to inconspicuous symptoms in adulthood depending on the nature of the mutations. Steroid 21-hydroxylase deficiency is also one of the most common metabolic disorder. Molecular genetic analysis of 21-hydroxylase gene has revealed that CYP21 gene deletions together with base substitutions in the CYP21 gene are responsible for CAH. It was also known that clinical presentation is strongly correlated with genotype. However, few data are available about mutational

spectrum of CYP21 gene in Korean patients with CAH.

In order to study the genetic basis of steroid 21-hydroxrlase deficiency in Korean patients with CAH, methods for genetic diagnostics were established by selective polymerase chain reaction amplification of CYP21, without contamination of pseudogene sequences, and direct sequencing of CYP21 genes. with this approach, the mutational spectrum of this gene was determined. It also enabled the investigation of relationships between genotypes and disease manifestation.

The observed results were as follows:

1. Deletion of CYP21 and six different mutations were identified in Korean patients with CAH due to 21-hydroxylase deficiency. Among these mutations, His245Tyr mutation was a new mutation found in the Present study, and Arg103Lys mutation was a silent mutation.

2. Frequencies of deletion of CYP21,I2 splicing mutation, lle173Asn mutation, His245Tyr mutation, Gln319stop mutation. Arg357Trp mutation, and Arg103Lys mutation among patients with 21-hydroxylase deficiency were 17.7%, 23.2%, 14.3%, 1.8%, 3.6%,

3.6%, 26.8%, respectively. Six mutations except silent mutation were responsible for the abnormalities in 57.2% of the affected genes.

3. Coexistence of mutations occurred, resulting in a total of 9 different combinations.

4. Clear relationships between genotype and clinical disease manifestation were demonstrated.

In conclusion, the mutational spectrum of the 21-hydroxylase gene in Korean patients with CAH was determined. And genotyping can be used to predict clinical outcome in patients with 21-hydroxylase deficiency, and to evaluate whether fetus is affected. Finally, typing of mutations in CYP21 is recommended for prenatal diagnosis of 21-hydroxylase deficiency.