백서에서 Bleomycin 투여로 인한 폐 손상 및 폐 섬유화에 대한 Penicillamine, Deferoxamine 및 Vitamin E의 영향

Abstract

[한글]

Bleomycin(BLM) 투여로 유발되는 폐 손상 및 폐 섬유화는 특발성 폐 섬유증의 실험적 모델로써 BLM의 폐 독성 기전은 산소유리기에 의한 직접 독성과 염증세포, 섬유아세포 및 세포외 기질에 의한 간접 독성으로 나누어 설명하고 있다. 이에 저자는 폐 손상의 주요 원인이 되는 산소유리기의 생성을 억제할 수 있는 킬레이트제와 이미 형성된 산소유리기를 보집할 수 있는 vitamin E를 투여하여, BLM에 의한 폐 손상 및 폐 섬유화의 발생과 그 억제기전을 이해하고자 본 실험을 시행하였다. 실험은 웅성 Wistar 백서에 BLM을 투여함과 동시에 1, 3, 4, 7, 14, 28일간 구리이온의 킬레이트제인 penicillamine, 철이온의 킬레이트제인 deferoxamine 및 수산기이온을 비롯한 여러 산소유리기의 보집제인 vitamin E를 투여한 후 기관지폐포 세척액 검사, 광학현미경 소견과 세포외 기질인 교원섬유 Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ형과 비교원성 기질인 fibronectin 및 laminin 그리고 근섬유아세포를 보기위한 NBD phallicidin에 대한 면역형광염색 및 면역조직화학염색 소견을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 기관지폐포 세척액의 검사소견상 총 세포수는 BLM 단독 투여군의 경우 제4일에 최고값에 도달한 후 감소하기 시작하여 제28일에 대조군과 비슷해졌지만, penicillamine과 deferoxamine 처치군은 제1일부터 제28일까지 계속 높았으며, vitamin E 처치군은 제3일부

터 현저한 차이로 감소하여 제7일부터 대조군과 비슷해졌다. 기관지폐포 세척액의 염증세포 구성비는 BLM 단독 투여군의 경우 초기 즉 제1, 3, 4일에 중성구가 현저히 증가하다가 제7일부터 감소하여 제28일에 대조군과 비슷해졌지만, vitamin E 처치군은 중성구의 비율이 제3일부터 BLM 단독 투여군의 1/3이하로 현저히 감소하였다.

2. 광학현미경 소견은 BLM 단독 투여군의 경우 다른 실험군에 비해 섬유화가 가장 심하였고, penicillamine 처치군에서는 중성구의 침윤이 지속적으로 많았다. Deferoxamine 처치군은 폐포 중격의 림프구 침윤이 뚜렷하였고, vitamin E 처치군은 폐포 중격 및 폐포강

내 대식세포의 증가가 많았는데, 이러한 소견은 기관지폐포 세척액 소견과 잘 일치하였다. 폐포상피세포의 증식은 penicillamine이나 deferoxamine 처치군에서 자주 관찰되었고, vitamin E 처치군에서는 BLM 단독 투여군이나 다른 약물 처치군에 비하여 적었다. BLM외 다른 약물 처치군의 섬유화 소견은 deferoxamine 처치군에서 가장 뚜렷하였고, penicillamine 처치군에서는 적었지만 관찰할 수 있었으나, vitamin E 처치군에서는 거의 없었다.

3. 세포외 기질의 변화로 폐포 간질의 기저막에 양성반응을 나타내는 제Ⅳ형 교원섬유와 laminin 및 Jones' methenamine silver 염색 결과는 비슷한 양상이었는데, BLM 단독 투여군, penicillamine 처치군과 deferoxamine 처치군은 모두 제28일군의 섬유화 부위에서 음성반응을 나타냈으나, vitamin E 처치군은 제28일까지 대조군과 비슷하게 기저막이 유지되었다. 섬유화 부위에 증가된 세포외 기질은 제Ⅰ형 교원섬유와 fibronectin이었으며, 제Ⅲ형 교원섬유는 각군에서 초기에 일시적으로 양성반응을 나타내었다. NBD phallicidin은 BLM단독 투여군에서 특히 제28일군 육아조직의 미세한 섬유성 물질에 양성반응을 보였다.

이상의 소견을 종합하면 bleomycin 투여에 의한 폐 손상 및 폐 섬유화 기전은 bleomycin이 구리 또는 철이온의 존재하에 생성한 산소유리기에 의해 유발될 수도 있으나, 주로 중성구의 활성화로 인한 산소유리기에 의해 유발되고, 폐의 섬유화는 제Ⅰ형 교원섬유와 fibronectin의 증가로 초래되었다. 폐 손상의 억제는 킬레이트제보다는 산소유리기의 보집제인 vitamin E 투여시 가장 효과가 있었는데, 이것은 초기의 중성구 증가 및 중성구의 활성화 정도에 따라 간질내 폐포의 기저막이 유지되거나 재생이 가능하여 폐의 탄력성을 유지시키면 폐 손상을 억제할 수 있기 때문으로 사료된다.

[영문]

Pulmonary toxicity by bleomycin has multiple mechanisms including direct toxicity due to oxygen-derived free radicals and indirect toxicity through amplification of pulmonary inflammation. In order to see whether chelators or vitamin E could reduce tissue damage induced by intratracheal bleomycin and to investigate the pathogenesis of bleomycin-induced pulmonary injury and fibrosis, penicillamine as a copper chelator, deferoxamine as an iron chelator, and vitamin E as a free radical scavenger were administered. Two hundred Wistar rats were divided into five groups(control group, bleomycin treated group, bleomycin-penicillamine treated group, bleomycin-deferoxamine treated group, and bleomycin-vitamin E treated group). Animals were sacrificed periodically at 1 day, 3 days, 4 days, 1 week, 2

weeks and 4 weeks after saline or bleomycin administration. Penicillamine, deferoxamine and vitamin E were pretreated and continuously administered until the time of sacrifice. The effects were compared to results of bronchoalveolar lavage fluid analysis, light microscopic findings, immunofluorescent stains for type Ⅰ and Ⅲ collagen, fibronectin, laminin and NBD phallicidin and immunohistochemical stain for type Ⅳ collagen.

The results were as follows:

1. There was a significant(p<0.05) increase in the total cell counts recovered

from the lavage fluid on Day 1 from animals treated with bleomycin alone, and

combined bleomycin-chelators or-vitamin E compared to the control group. However,

only the vitamin E treated group revealed an abrupt decrease in the total cell

counts on Day 3. The neutrophils began to appear in significant amounts in the

lavage fluid on Day 1 after bleomycin alone and combined bleomycin-chelators

or-vitamin E treatments. A significant decrease in neutrophil concentration(less

than one third of bleomycin treated group) was obtained at 3 days in the

bleomycin-vitamin E treated group. The bleomycin-penicillamine treated group showed

a prolonged increase in total cell counts and neutrophil concentration, while the

bleomycin-deferoxamine treated group revealed an outstanding increase of lymphocyte

concentration on Day 4.

2. Histologically the degree of pulmonary fibrosis was most prominent in the

bleomycin treated group, while diffuse alveolar damage was continuously observed in

the bleomycin-penicillamine treated group and extensive interstitial lymphocytic

infiltration was seen in the bleomycin-deferoxamine treated group, The

bleomycin-vitamin E treated group disclosed the least histologic changes.

3. The alveolar interstitial basement membranes were positive for type Ⅳ

collagen and laminin bleomycin treated group and combined bleomycin-penicillamine

or-deferoxamine treated groups were disrupted and fragmented on Day 4 or 7. The

bleomycin-vitamin E treated group demonstrated intact alveolar basement membranes

until Day 28. Type Ⅰ collagen and fibronectin accumulated in the fibrotic foci,

while type Ⅲ collagen was initially predominant in the thickened alveolar septa

and interstitium. A few myofibroblasts positive for NBD phallicidin were observed

in the granulation tissue of bleomycin treated group.

In conclusion. bleomycin-induced pulmonary fibresis was related to the severity

ef acute injury due to direct toxicity of oxygen radicals or activation of

neutrophils and disruption of alveolar interstitial basement membranes. In this

study vitamin E acting as a scavenger of neutrophil-de-rived free radicals and

suppressant of lipid peroxidation, seemed to be the most effective antioxidant in

the inhibition of bleomycin-induced pulmonary injury and fibrosis.