Immunoblot을 이용한 혈청내 항핵항체의 분석

Abstract

[한글]

전신성 홍반성 낭창(Systemiclurus erythematosus,SLE)등의 자가면역질환은 유색인종에 더 많고 그 증상도 심하다고 한다. 우리나라에서도 근래에 자가면역질환에 대한 관심이 모아지기 시작하였다. 자가면역질환의 진단 또는 추적검사에는 간접면역형관법의 항핵항체 검사법(Fluorescent antinuclear antibody test, FANA)이 현재 보편적으로 이용되고 있으며, 항핵항체의 아형검사법으로는 최근 이중면역확산법(Double immunodiffusion, DID

)이 쓰이기 시작하였다. 그러나 간접면역형광법은 감도가 떨어지고 항핵항체의 아형에 따라 세분하여 검출할 수 없는 단점을 가지며, 이중면역확산법은 각 아형마다 따로 검사해야 하므로 고가이고, 반응시간이 적어도 24시간으로 길며 판독시 침강선이 뚜렷하지 않은

단점들이 있다. 따라서 자가면역질환을 대상으로 하여 감도와 특이도가 높으며 좀 더 개선된 항핵항체 검사방법을 개발하고자 시도하였고, 그 개발된 조건을 이용하여 임상환자를 대상으로 실험하여 그 유용성을 평가하고자 하였다.

Immunoblot법은 최근 항원의 특성 분석법으로 널리 쓰이며 분자량에 따라 반응 분획이 나타남으로 이 방법을 적용하면 Nonhistone protein에 대한 항핵항체의 여러 아형을 단회 검사로 검출할 수 있는 장점을 가진다. 또 이 방법은 감도와 재현성이 우수하고, 항원을

미리 전기영동하고 Western blot을 시행하여 항원 지봉을 준비하여 두면 비교적 간편하게 환자의 진료에 이용할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 가능성을 가진 Immunoblot법을 항핵항체 성분분석에 적용하여 우리 검사실 실정에 맞는 조건을 개발하였다.

그리고 간접면역헝광법의 항핵항체 선별검사 결과가 양성이면서 SLE로 확진된 환자 25명과 그외 기타 자가면역질환자 10명을 대상으로 총 35명의 환자 혈청에서 항핵항체를 Immunoblot법으로 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 선별검사 목적으로 본 실험의 최적 조건은 항원으로 토끼흉선 추출물과 우비장 추출물을 같이 사용하는 것이, 항원 농도는 각각 1mg/ml이, 그리고 1:50의 환자 혈청 희석배수가, conjugate는 항 human IgG-Alkaline phosphatase l:500의 희석배수가 적당하였다.

2. 특이 표준항체를 토끼흉선 추출물과 우비장 우출물을 항원으로 하여 Immunoblot한 결과는 중복이 되지 않는 각 항핵항체 아형 성분의 특이분획으로 항 RNP항체는 70, 22 kDa에서, 항 Sm항체는 26 kDa에서, 항 SS-A(Ro)항체는 64, 52 kDa에서. 그리고 항 SS-B(La)항체는 47 kDa 에서 나타남을 알 수 있었다.

3. 25명의 SLE환자군에서는 각각 1-9개의 분획이 비교적 뚜렷하게 관찰되었고, 가장 출현빈도가 높았던 특이분획은 토끼흉선 추출물을 항원으로 사용하였을 때는 52(56%), 41(44%), 22(40%)kDa의 순 이었다. 우비장 추출물을 항원으로 사용하였을 때는 95(57%), 64(5

7%)kDa의 분획과, 22(43%), 47(38%)kDa의 분획 순으로 검출되었다. 4. 특이 표준항체의 Immunoblot분석 결과를 기준으로 SLE환자에서 나타난 Immunoblot특이분획의 아형 검출빈도는 항 SS-A(Ro)항체가 72%에서 양성으로 가장 높은 빈도를 보였고, 그 다음은 항 SS-B(La)항체의 52%, 항 RNP항체의 48%, 항 Sm항체의 40% 순 이었다.

5. Immunoblot법과 이중면역확산법을 이용한 항핵항체 아형의 양성율은 항 RNP와 Sm의 공통항체검사에서 자자 71%, 43%의 양성율을 보였고, 항 SS-A(Ro)와 SS-B(La) 항체검사에서는각각 81%. 48%의 양성율을 보여 Immunoblot법에서 감도가 우수하였다(각 p<0.001).

6. 각 장기병변과 Immunoblot분획간의 상관성은 신장병변을 보인 10명의 SLE환자 중 토끼흉선 추출물을 항원으로 한 Immunoblot에서는 52(60%), 47(50%)kDa 분획이, 우비장 추출물을 항원으로 하였을 때는 95(78%), 64(56%), 22(56%)kDa분획이 빈번히 관찰되었다.

7. 현재 쓰이고 있는 항핵항체 선별검사법인 간접면역형광법에 의한 면역형광 역가와 양상 결과를 Immunoblot법과 비교한 결과, 면역형광 역가가 높을수록, 또 speckled형을 보일수록 Immunoblot분획의 수가 많고 진함을 관찰하였다.

이상의 결과를 종합하여 보면, Immunoblot을 이용한 혈청내 항핵항체 분석 검사는, 비교적 간편하고 판독이 용이하며 임상환자의 진단용으로 감도가 높은 방법으로서, 단회 검사로 항핵항체 중Nonhistone protein항원에 대한 항체의 주요 아형까지 검출해낼 수 있는 유용한 선별검사법으로 생각되었다. 또한 이 방법은 다른 종류의 항핵항체 아형 검출에도 적용하면 그 임상적 유용성이 더욱 클 것으로 기대되었다.

[영문]

It is well known that the American Indian, Blacks, and Orientals are predisposed to systemic lupus erythematosus(SLE) and the symptoms of the disease are more severe in these ethnic groups. There are growing interests about these autoimmune diseases including SLE in Korea. Therefore, great efforts have been made to develop a sensitive and specific diagnostic method for the autoimmune diseases. To date, indirect immunofluorescent antinuclear antibody (ANA) test has been widely used for the diagnosis of SLE. But, it suffers from the lack of subtype specificity and is influenced by the substrate used. Currently, the immunohistochemical method gives us only the information on the pattern and titer of ANA present in the SLE patients. In this study, attempts were made to increase the sensitivity and specificity of ANA test, in addition to the extent of ANA specificities by immunoblot technique and the following results were obtained.

1. 1 mg/ml of rabbit thymus extract(RTE) and bovine spleen extract(BSE) as antigens, 1:50 diluted patients' sera, and 1:500 diluted antihuman IgG-alkaline phosphatases gave optimal results for this study.

2. Immunoblot analysis by specific anti-RNP antibody revealed 70, 22 kDa proteins, anti-Sm antibody revealed 26 kDa, anti-SS-A(Ro) antibody revealed 74,52 kDa, and anti-SS-B(La) antibody reacted with 47kDa proteins in combined use of the RTE and BSE.

3. Immunoblot analysis of 25 SLE patients' sera showed 1-9 discrete immunoreactive protein bands whereas only 2 of 10 normal control subjects showed only nonspecific bands. Especially, when the SLE patients' sera were reacted with RTE, 52 kDa(56%), 41 kDa(44%),22 kDa(40%) and with BSE, 95 kDa(57%), 64 kDa(57%)

and 22 kDa(43%), 47 kDa(38%) were observed.

4. Anti-SS-A(Ro) was observed in 72% of SLE patients tested, 52% of patients were shown to have anti-SS-B(L3). Anti-RNP, and anti-SM antibodies were detected in 48% and 40% of SLE patients as revealed by immunoblot analysis.

5. The sensitivity of the immunoblot analysis was confirmed by comparing the positive rates between the immunoblot and double immunodiffusion technique when tested with anti-RNP, anti-Sm, anti-SS-A(Ro),anti· 55-B(La) antibodies.

6. The antisera from 10 SLE patients having renal involvements showed 52kDa(60%) and 47kDa(50%)protein bands when RTE was used as a antigen and 95 kDa (78%), 64 kDa(56%), 22 kDa(56%) protein bands were observed with BSE as a antigen.

7. Some patients having high ANA titers or speckled patterns revealed more fraction numbers and stronger immunoreactive bands in immunoblot.

Taken all the results together, it is concluded that the immunoblot method can be a specific alternative to immunofluorescent technique currently in use since this

method provided a sensitive and rapid identification of ANA and its subtypes in a single experiment.