수술전 total lymphoid irradiation(TLI)이 신장이식 후 거부반응에 미치는 영향에 관한 연구

Abstract

[한글]

장기 이식수술이 실패하는 주된 원인은 이식조직인 이물질에 대한 수여자(recipient)의 거부반응때문이다.

거부반응은 면역학적으로 이식조직 혹은 장기에서 유리된 항원이 수여자의 임파구를 특이하게 조작시켜 이 특이하게 조작된 세포들에 의하여 공여자의 항원이 인지되면 molecular cascade system등과 cellular mechanism들이 동시에 함께 작용함으로써 확대표시되어 일어나는 것으로 알려지고 있다.

이와같은 거부반응을 정복하는 방법들로는 첫째, 항면역 약물요법이 있으며, 이것으로는 azathioprine, crtoxan, steroid등과 항임파구 제재인 ALG, ALS, 또는 ATG등이 있으며, 최근에 항진균 제재인 cyclosporin A가 개발되어 실험단계에 있다.

둘째로는 임파조직의 기능을 억제하는 방법으로서 방사선요법, 비장적출술, 흉선적출술 및 흉관배액술 등이 있다. 셋째로는 특수한 생물학적인 방법으로 면역학적인 내약력(tolerance)이나 증진력(enhancement)을 유도하는 방법이다. 이는 이론적으로는 이상적인 방법이나 실제로는 동물실험에서나 가능하고 인체에서는 아직까지 사용하기 어려운 실정이다. 따라서 이상의 모든 방법들중에서 실재로는 maximum tolerable dose의 azathioprine

과 minimum maintenance dose의 steroid를 사용하면서 ALG 혹은 ATG를 겸용하며 필요에 따라서 국소방사선요법을 사용하는 것이 일반적인 방법으로 이용되고 있으나, 이것도 한계에 이르렀으며 완전히 만족할만한 것이 못되는 실정이다.

최근에 들어서는 조직형이 맞지 않는 큰 동물에서 상기와 같은 일시적인 면역억제가 아닌 영구적인 면역억제를 시키기 위한 여러가지 치료방법이 연구되어지고 있는 바이다.

1950년대 초기에는 Rosenthal(1951)과 Metcalf(1950)등은 midlethal dose의 방사선 조사를 행하여 골수기능을 완전 저하시켜서 항체형성을 감소시키는 것을 알았고, 그후 전신조사(total body irradiation; TBI)를 시도하였으나 면역반응이 억제되었음에도 불구하고 방사선조사에 의한 위험성과 실용성이 없는 효과(unpredictable effectiveness)로 인하여 뚜렷한 호응을 얻지 못하였다. 1960년대에는 신장이식수술전이나 수술후에 이식조직에 국소방사선조사를 하거나 비장에 방사선조사를 행하여 방사선조사에 대한 위험도가 적으면서도 이식신의 거부반응이 효과적으로 억제되는 것을 발견하였으며, 이에 착안하여서 전임파조사(total lymphoid irradiation:TLI)를 시작하여 성숙쥐와 설치류동물(rodent)에 시도하여 본 결과 영구적 수용(permanent acceptance)이 성공하기에 이르렀다.

그러나 쥐와 생쥐의 chimera는 골수조직에 특히 잘 견디는 경향은 있더라도 더 큰 동물에서도 동일한 것은 아니므로 더 큰 동물이나 인체에서도 TLI을 이용하여 면역억제를 일으키는 영향력과 graft versus host disease(GVHD)를 예방할 수 있는 방법들이 연구과제

가 되고 있다.

1981년 Howard등은 TLI와 동시에 비장 절제술을 시행하여 신장동종이식수술을 하였던 개에서 생존기간이 연장되었음을 보고한 바 있다.

본 연구에서는 조직형이 맞혀지지 않은(tissue unmatched)개에서 이식거부반응없이 장기이식을 성공시키는데 TLI조사가 미치는 영향을 알고저 하였으며 이를 토대로 인체에서 장기이식에 TLI의 이용가능을 알고저 시도하였다.

기기로는 Co**60원격조사장치를 사용하였으며 아울러 신장이식수술후에 이식신에 나타난 변화를 광학현미경 및 전자현미경으로 알아보고저 하였다.

실험재료 및 방법

본 연구의 대상으로는 체중 15kg의 잡종견을 선택하였으며 실험대조군 8마리와 실험 TLI군 12마리를 대상으로 하였고 양군 모두 조직형검사는 하지 않았다.

실험대조군 :조직형을 맞히지 않은 잡종견 8마리로서 신장이식수술전에 방사선 조사를 받지 않은 군.

실험 TLI군 :조직형을 맞히지 않은 잡종견 12마리로서 신이식수술전에 Co**60원격조사장치를 이용하여 TLI와 비장에 방사선조사를 받은 군.

실험대조군에서는 8마리의 정상 잡종견끼리 신장이식수술을 받았으며 수술후 매 3일마다 백혈구수치, 혈색소치, 그리고 혈중 creatinine를 측정하였으며 실험 TLI군에서는 신장이식수술을 받기전에 Co**60원격조사장치를 이용하여 TLI와 비장에 방사선조사를 행하여 총 1,710 rads를 6회 분할조사(fraction)하였고 분당 29.4 rads의 선량율로서 1회에 285 rads를 1주당 3∼4회 조사하였으며, source skin distance는 133cm였다. 매회 초에는 확인사진(gammagram)을 촬영하여 조사부위를 확인하거나 교정하였고 TLI의 조사부위는 두개골 기저부부터 꼬리에 이르는 척추, 액와부, 종격동 그리고 양측 서혜부가 포함되도록 하였고 TLI의 폭은 약 8cm넓이로 조사하였고 불필요한 폐와 복부장기는 5cm두께의 납벽돌

로 차폐하여 주었다. TLI와 비장 방사선조사 완료후 1∼7일 이내에 비방사선조사군인 조직형을 맞히지 않은 공여견으로부터 신장을 이식받았으며, 수술은 개복후 이식술을 시행하였고 본래의 양측신장을 적출하였다.

신장이식술후 수여견의 사망시까지 매 3일마다 백혈구치, 혈색소치와 혈중 creatinine치를 검사하였고 실험대조군과 실험 TLI군에서 수술 제6∼7일에 Tc**99m DTPA을 주사한 즉시 OPTI-CAMERA Mu-3000와 IMAC 7300 computer data processing system (CGR Co. France)을 이용하여 신스캔과 renogram 및 renograrn곡선의 20분에서 bladder/kidney(B/K) uptake ratio을 조사하여 이식신의 신장기능을 관찰하였다.

이식견의 사망시 일부신조직을 10% 중성 formalin에 고정하였다가 시상절단조각편을 hematoxylin eosin(HE) 염색, phosphotuncstic acid hematoxylin(PTAH)염색과 trichrome(TCS)염색을 행하여 광학현미경상에 나타난 이식신의 변화를 관찰하였으며 일부 이식신의 조각을 1×1mm**3로 세절하여 3% glutaraldehyde용액에 고정하였다가 1% osmium tetraoxide용액에 재고정하여 통상 제조과정을 통하여 uranyl acetate와 lead citrate로 염색하여 전자현미경상의 이식신 변화를 연구하였다.

연구성적 및 결론

1. 신장이식수술을 받은 실험대조군의 이식조직 생존기간은 평균 3.4±1.05일이였으며 잡종견의 생존기간은 평균 6.29±1.58일이었음에 비하여 실험 TLI군에서의 이식조직 생존기간은 평균 9.8±4.21일 이었고 잡종견의 생존기간은 평균 11.5±3.29일로서 신장이식 수술을 받은 실험 TLI군에서의 생존기간이 월등히 높은 것을 관찰할 수 있었다.

2. 실험대조군에서는 신장이식수술후 보다 사망시에 백혈구 수치가 월등히 증가된 양상을 보였고 혈중 혈색소치는 사망시예 평균 9.2±3.92gm%로서 이식신의 거부반응의 소견을 볼 수 있었고 실험 TLI군에서는 사망시에 심한 백혈구 감소증과 심한 빈혈을 나타내어서

TLI로 인한 전임파조직과 골수의 억제로 인하여 면역억제의 효과가 월등히 높았음을 알 수 있었다.

3. 실험대조군의 혈중 creatinine치는 수술후 제3일부터 월등히 증가하여 사망시는 최고 18.7mg%까지 상승하는 심한 이식거부반응을 보였고 실험 TLI군의 60%에서 수술후 제9일부터 혈중 creatinine치가 경하게 증가되어서 실험대조군보다 경하고, 지연되어 나타나는 신기능부전 소견을 나타내었으며 나머지 40%에서는 사망시까지 혈중 creatinine치가 정상이었다.

4. Tc**99m DTPA renogram을 시행한 결과 실험대조군에서는 renogram곡선상에서 모두 이상소견을 보이고 20분 bladder/kidner uptake ratio는 정상이하이었다. 실험 TLI군에서는 합병증이 생긴 2예를 제외하고 renogram곡선과 bladder/kidney uptake ratio에는 정상소견을 보였다.

5. 육안적으로 보아 실험대조군의 이식신장의 크기가 월등히 비대되어 있었으며 신피질의 두께도 증가된 반면 실험 TLI군에서는 1예 제외한 모든 잡종견에서 이식신장의 크기와 신피질의 두께는 정상이었다.

6. 광학현미경 소견상 실험대조군에서는 신사구체의 변성 및 괴사, glomerular ㅠ basement membrane(GBM)의 비후와 섬유혈전, 신간질의 부종, 출혈 및 단핵구세포침착, 모세혈관의 충혈 및 혈관염 그리고 신세뇨관의 괴사등의 신이식 거부반응을 뚜렷이 보였음에 비하여, 실험 TLI군에서는 신사구체와 신세뇨관에 경한 변성이나 괴사, 신간질의 경한 부종 및 염증세포침윤만을 보였고 실험대조군과는 달리 신이식거부반응의 소견은 경미하거나 전혀 보이지 않았다.

7. 전자현미경 소견상 실험대조군에서는 심한 이식거부반응을 보여서 신사구체총에 내피세포증식, 심한 변성 및 괴사의 소견으로 모세혈관내공이 확장되었고 Bowman씨 낭내에는 단백질양 cast가 차 있었으며 GBM의 경하고 불규칙한 비후현상과 모세혈관내에 혈소판

의 소견이 보였다. 신세뇨관기저막에 심한 비후, 분열과 교질섬유침착이 보였으며 상피세포의 핵이 위축되었고 핵염색질의 비정상적인 응집과 세포질내 기공형성의 소견을 나타내었다. 신간질내에도 혈관벽에 교질성 섬유침착과 증세포침윤으로 혈관내강이 좁아지는 혈관염을 나타내어 이식신의 이식거부 소견을 보였다. 이에 반하여 실험 TLI군에서는 신사구체나 신세뇨관의 소견은 경미하거나 거의 정상이었다.

[영문]

The main cause of organ allograft failure is host's rejection reaction against the grafted organ.

The allograft rejection is known to be resulted from recipient's immunological mechanism stimulated by donor histocompatility antigen.

The T lymphocyte is sensitized by recognition of challenged donor histocompatibility antigen and start to develop cellular immunity. On the other handm, B lymphocyte is stimulated by the helper cell and start to proliferate and differentiate to the plasma cell and produce specific antibody or immunoglobulins.

Molecular cascade systems such as complement system, clotting system, kinin system are activated by the antigen antibody complex and join the rejection reaction along with the cellular mechanisms touch as monocytes, macrophages, polymorphonuclear leukocytes and platelets to complete rejection phenomenon.

The definite method of controlling the rejection is not known yet, however, general methods of immune supperession are induction of immunological tolerance and enhancement, chemical immunosuppressive therapy, antilymphocyte globulin, and various methods of irradiations with or without splenectomy, thymectomy or thoracic duct drainage.

Maximal tolerable lese of azathioprine and minimum maintenance dose of steroid methods are generally used at present, however, those can not be the prime method although(Najarian and Simmon, 1972; Ki Il Park, 1980).

Recently, for the permanent and prolonged immunosuppresions, variable studies has been done using the tissue unmatched, nonrelated, sex mismathed large animals. In the early 1950's, Rosenthal and Metcalf recognized great risks, hazard, and

unpredictable effectiveness of total body irradiation as a stole modalities of immunosuppressions, even though they observed marrow suppression of erythropoiesis and granulocytopoiesis in rat with midlethal dose irradiation, and depressed or impaired antibody formation of response after whole body irradiation.

Through the method of graft or splenic irradiation in 1950's, total lymphoid irradiation could induce a stale where transplanted allogeneic bone marrow resulted in chimerism, and permanent acceptance of organ allografts from donor strain against the major histocompatibility differences were present and definite mechanism of TLI was not known in 1970's(Slavin et al, 1976-1979).

In practice, Howard (1981) reported prolonged survival of 2 DLA tissue matched allografted dogs. if pretreated wish splenectomy and TLI before renal transplantation.

Author aimed to study radiation effectiveness after TLI in tissue unmatched, unrelated large animal renal transplantation.

Total lymphoid and splenic irradiation were done using Co**60, 1.25 MeV high energy unit at distance of 133cm source skin distance(SSD).

Methods and material

Outbred mongrel does of about 15 kg body weight and the dogs were tissue unmatched for histocompatibility antigens. Donor and recipient pairs were unrelated and sex mismatched.

experimental control group:

8 mongrel dogs of DLA tissue unmatched without TLI irradiation before renal transplantion.

experimental TLI group:

12 mongrel dogs of DLA tissue unmatched with TLI and splenic irradiation before rectal transplantation using Co**60 unit.

Experimental control group had exchange renal transplantation and experimental TLI group received nonirradiated donor kidney.

All the hematologic studies including WBC, hemoglobin, and blood creatinine value were repeatedly checked in every 3 days till death of dogs.

The dogs were received 285 rads per fraction, 29.4 rads/min dose rate for 3∼4 days per week for 2 weeks interval. On the begining day, every dogs were checked gammagram to decide radiation exposure to the appropriate area of TLI. Radiation

field extended from the base of skull to tail of animal including spleen with the width of 8 cm. The entire neck, both axilla, mediastinum, midabiomen, pelvis, both groin and spleen were included in their radiation field, however, the lungs and

lateral aspect of abdomen were shielded using 5 cm thick lead block.

Within 1∼7 days after completion of TLI and splenic irradiation, kidney transplantation was performed after bilateral nephrectomy according to the standard technique.

In post-op. 6∼7 days, Tc**99m DTPA renal gamma scan and renogram with bladder/kidney uptake ratio at 20 minute after radioisotope injection were done in transplanted kidney using CGR OPTICAMERA Mu-3700 and IMAC 7300 computer data processing system for observing function of transplanted kidney.

Autopsy were done in each renal transplanted dogs after immediate death. and A piece of kidney were fixed at 10% neutral formalin for HE stain. PTAH stain and TCS stain for light microscope and small cubes from the center of the biopsies were

preserved in 3S% glutaraldehyde solution and refiled in palads buffered 1% osmium fixative. Then they were stained in uranyl acetate and lead citrate for electron microscope analysis.

Results

1. The 8 experimental control group revealed mean graft survival of 3.4±1.05 days, and mean dog survivals were 6.29±1.56 days.

12 experimental TLI group revealed longer renal allograft functions with mean graft survival of 9.8±4.21 days and dog survivals of 11.5±3.25 days.

2. Experimental control group rejected allografted kidney and showed progressive elevation of WBC count(17,928±15,650.0/mm**2) at death with normal hemoglobin level of 9.2±3.92gm%.

In experimental TLI group, severe leukopenia(1,584.2±699.3/mm**3) and severe anemia(3.91±2.486 gm%) at death were suggestive of effective immunosuppression

with TLI in entire lymphnodes and spleen.

3. The serum creatinine level in experimental control group showed already more than 3mg% on the 3rd posttransplantation day, and reached to 18.7 mg% suggesting severe rejection phenomenon with impaired renal function. In experimental TLI group showed normal or mild elevation of serum creatinine elevel.

4. Tc**99m DTPA renal gamma scan, renogram, bladder/kidney uptake ratio in experimental control group revealed all abnormal, impaired renal function, however, renal function in experimental TLI group preserved well in allografted kidney.

5. Gross findings of renal size and renal cortex thickness showed enlargement with ill defined corticomedullary junction with congestion in experimental control group, and normal renal size and cortex thickness in experimental TLI group with preserved corticomdullary junction comparable to renal size at time of transplantation.

6. In light microscopic findings, experimental control group showed glomerular degereration, necrosis, GBM thickening, capillary tuft fibrin thrombi, renal thbular necrosis, TEM thickenning, and interstitial edema, mononuclear cell infiltration, capillary fibrin thrombi, and vasculitis. However, experimental TLI group showed almost normal findings except wild glomerular, and tubular degeneration with mild inflammatory cell infiltration.

7. In Electron microscopic findings were glomerular capillary tuft degeneration, necrosis and endothelial cell proliferation with thrombocyte, and protein cast in Bowman's space along with GBM thickenning in experimental control group. Renal cortical and medullary tubules showed severe degeneration of epithelial cell, with shrinked nucleus, clumped chromatin and vacuolization of cellular cytoplasm, and interstitial severe mononuclear cell infiltration with vasculitis or vascular fibrinoid degeneration in experimental control group suggesting rejection. In contrast, glomerulus and renal tubules appeared almost or complete normal in experimental TLI group.