방광내 BCG 주입에 따른 방광조직 및 말초혈액 단구의 Tumor Necrosis Factor-α 발현

Abstract

[한글]

표재성 방광암은 bacillus Calmette-Guerin(BCG)에 의한 면역요법이 이용되는 대표적인 종양중의 하나이다. 표재성 방광암의 BCG 방광내 주입요법은 방광암의 재발방지 뿐만 아니라 잔류 종양과 상피내암에 대해서도 효과적인 치료방법으로 인정되고 있다. BCG의 항종양 작용기전은 잘 알려져 있지 않으나 면역학적 기전이 중요하며 BCG 방광내 주입 후 오줌내 tumor necrosis factor(TNF)-α의 증가는 TNF-α가 BCG 면역요법과 관계있음을 암시한다. BCG주입 후 말초혈액 단구 및 혈청내 TNF-α는 증가하나 생체내 반감기가 짧은 것으로 보아 전신적 TNP-α 증가가 국소 방광조직에 있는 암세포에 어떤 영향을 미칠지는 확실하지 않으며 오줌내 TNF-α의 유래가 방광내 침윤된 단핵구의 면역반응과 관계있을 것으로 생각되나 그 증거는 확실하지 않다. 또한 주로 활성화된 T 림프구에서 분비되는 interferon(IFN)-γ는 단구/대식세포를 활성화시켜 활성화된 단구/대식세포가 TNF-α 생성을 증가시킬 것으로 기대되어 BCG와함께 표재성 방광암의 면역요법에 사용될 수 있는 가능성이 있다.

따라서 본 실험은 TNF-α 형성 세포주인 HL-60과 사람 말초혈액 단핵구를 시험관내에서 BCG 및 여러 농도의 IFN-γ로 자극한 후 TNF-α mRNA 발현 양상을 관찰하고, 또한 마우스에 BCG 혹은 BCG 및 IFN-γ를 주입할 때 비장 및 국소 방광조직의 TNF-α mRNA의 변화를 비교하여 표재성 방광암 치료에 BCG와 함께 IFN-γ의 사용가능성 여부를 알아보고자 하였다. 또한 방광내 BCG 주입 후 오줌내 TNF-α 증가가 전신 면역반응에 의한 것인지 혹은 국소방광조직에 침윤된 단핵구에서 분비된 것인지를 TNF-α mRNA의 변화를 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. HL-60 세포주에 대한 BCG와 IFN-γ(57U/m1 또는 570U/m1) 혼합 자극시 BCG 단독보다 TNF-α mRNA 생성이 증가되었다.

2. 정상성인 말초혈액 단구에 대한 BCG와 IFN-γ(50U/m1 또는 500U/ml) 혼합 자극시 BCG 또는 IFN-γ의 단독자극보다 TNF-α mRNA 생성이 증가되었다.

3. 마우스 방광내에 BCG를 투여함에 따라 비장의 TNF-α mRNA 생성은 대개 BCG 투여1∼2 주 후 가장 높이 증가되었다가 이후 점진적으로 감소하는 경향을 보였다.

4. 마우스 방광내에 BCG를 투여함에 따라 방광조직의 TNF-α mRNA 생성은 대개 BCG투여 1 주 후 증가되었다가 점진적으로 감소하는 경향을 보였다.

5. BCG를 주입한 마우스 방광내에 IFN-γ 주입에 의한 비장 및 방광조직에서 TNF-α mRNA 생성의 상승효과는 나타나지 않았다.

이상의 결과로 방광내 BCG 주입은 전신 면역반응과 함께 방광조직의 국소 면역반응을 유발하여 TNF-α 생성을 유도하리라 생각된다. 사람의 말초혈액 단구 및 HL-60 세포주의 BCG 자극에 따른 TNF-α mRNA 생성은 IFN-γ 첨가에 의하여 더욱 증가하였으나, 마우스 방광내에 BCG와 IFN-γ의 병용 주입은 BCG 단독 주입에 의한 비장 및 방광조직 TNF-α mRNA 생성보다 더 증가되는 효과를 나타내지 않았다. 그러므로 사람에서 BCG와 IFN-γ의 병용요법을 적용하기 위하여는 IFN-γ 용량 및 주입 경로에 따른 TNF-α 생성능 변화를 좀 더 연구하여야 할 것으로 생각된다.

[영문]

Intravesical therapy with bacillus Calmette-Guerin(BCG) is highly effective in the prophylaxis of recurrent superficial bladder cancer and in the therapy of carcinoma in situ of the bladder. Although the mechanism of BCG immunotherapy has not been clearly understood, the antitumor mechanism is thought to be highly associated with immunological responses. The effective immunological mediators, such as interleukin(IL)-1 and IL-2, are secreted into the urine of patients after intravesical BCG therapy. Specially tumor necrosis factor(TNF)-α is remarkably

elevated in 2 to 8 hours. However the half life of TNF-α in the blood is very short, so the origin of TNF-α in urine of patients after intravesical BCG therapy may be related to the local immune response of the bladder, but the evidences for this are not clear.

Interferon(IFN)-γ is known as an activator of monocytes and macrophages, so it may be expected that systemic and local productivity of TNF-α can be enhanced by administration of IFN-γ in combination with BCG.

So in an attempt to observe the possibility of application of IFN-γ in BCG immunotherapy and to identify the origin of TNF-α of urine, after intravesical instillation of BCG, we studied the TNF-α mRNA production in HL-60 cell line and human peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) by Northern blot hybridization

analysis after stimulation with BCG and/or IFN-γ. Fur-thermore we measured TNF-αmRNA production in the spleen and bladder of mice by slot blot hybridization analysis after intravesical instillation of BCG and/or IFN-γ.

The results are as follows.

1. TNF-α mRNA production in HL-60 cell line stimulated by IFN-γ in combination with BCG was more increased than that stimulated by BCG or IFN-r alone.

2. TNF-α mRNA production in PBMNC stimulated by IFN-γ in combination with BCG was also more increased than that stimulated by BCG or IFN-γ alone.

3. The maximal production of TNF-α mRNA production in spleen was seen after first or second intravesical instillation of BCG in mice.

4. The maximal production of TNF-α mRNA in bladder was seen after first intravesical instillation of BCG in mice.

5. Synergistic effect of IFN-γ and BCG on the production of TNF-α mRNA in spleen and bladder of mice by BCG immunotherapy was not observed.

In conclusion, the increment of TNF-α mRNA production in bladder and spleen of mice after intravesical instillation of BCG might be considered due to the local immune response as well as systemic immune response. Although TNF-α mRNA production in HL-60 and PBMNC was more enhanced by addition of IFN-γ to BCG, no

increases of it in the spleen and bladder of mice were observed. Therefore, further studies are necessary for the determination of applicability of IFN-γ in combination with BCG in immunotherapy of superficial bladder cancer.